亚洲棉短纤维发育相关长链非编码RNA的鉴定及表达

【目的】长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类无蛋白质编码能力，但参与许多重要生命活动调控过程的长度大于200 nt的RNA。通过对亚洲棉无短纤维突变体（GA0149）和野生型（GA0146）纤维发育早期的转录组数据进行分析，挖掘调控短纤维发育的lncRNA，并明确其调控网络，为进一步解析棉花纤维发育机制奠定基础。【方法】选择GA0146和GA0149 2个材料在开花后当天（0 DPA）及花后3 d(3 DPA)、5 d(5 DPA)和8 d(8 DPA)的胚珠和纤维为材料进行转录组测序。鉴定lncRNA并预测其调控的靶基因；通过mRNA和lncRNA的差异表达分析，比较2个材料在不同纤维发育时期的差异。进一步利用KOBAS软件预测对差异lncRNA的靶基因进行富集分析并预测其参与的生物过程；最后通过实时荧光定量（RT-qPCR）技术对25个差异表达的lncRNA转录组数据进行验证。【结果】共鉴定获得15 339个lncRNA，其中11 595个lncRNA位于基因间区，包括2 428个反义lncRNA、350个内含子lncRNA及966个正...     

陆地棉胚珠及纤维发育过程中miRNA分离与鉴定

microRNA(miRNA)是生物中一类起负调控作用的非编码的小分子RNA,主要在转录后水平上调节生物体的生长与发育。直接克隆法是鉴定植物中miRNA最常用也是最有效的方法之一。利用直接克隆法分离了陆地棉开花后0~10 d(days post anthesis, DPA)胚珠中总RNA,从中筛选17~24 nt小分子RNA构建cDNA文库,对初筛得到的阳性克隆进行测序。通过与miRNA数据库比对,最终获得4个保守的miRNA。进一步对他们的转录表达进行分析,发现所有miRNA在棉花胚珠纤维不同发育时期均能表达。其中miR167a、miR172c和miR394b在棉花幼苗的根茎叶中有不同程度的表达。预测得到55个miRNA的靶基因,多数靶基因编码转录因子、代谢酶类以及发育相关蛋白,进一步证明miRNA参与调控棉花纤维的形态建成、发育等各项生理活动。     

干旱胁迫下油菜素内酯浸种对棉花种子萌发期NAC转录因子表达的影响

【目的】研究干旱胁迫下油菜素内酯浸种棉花种子萌发期NAC转录因子的表达变化,分析NAC转录因子在油菜素内酯(brassinolide,BR)调控棉花抗旱中的作用。【方法】根据陆地棉转录因子NAC家族的基因序列,扩增获得棉花新陆早17号NAC家族中的6个NAC基因(Gh NAC1-6)。实时荧光定量PCR检测干旱胁迫下不同油菜素内酯浸种后,棉花种子萌发期子叶和胚根NAC基因的表达变化。【结果】棉花子叶中的Gh NAC1在干旱胁迫下受不同浓度油菜素内酯的抑制,Gh NAC2和Gh NAC3受0.25 mg/L油菜素内酯诱导表达,Gh NAC5只受0.5 mg/L油菜素内酯诱导表达,而Gh NAC4和Gh NAC6表达无显著变化。在棉花胚根中,Gh NAC1同样受不同浓度油菜素内酯的抑制,Gh NAC2和Gh NAC3受0.25 mg/L油菜素内酯诱导,同时Gh NAC3在2 mg/L油菜素内酯浸种也呈现高表达,Gh NAC5无显著变化,Gh NAC4和Gh NAC6则受高浓度油菜素内酯诱导表达。【结论】棉花种子萌发期在干旱胁迫下,棉花种子萌发期子叶和胚根的Gh NAC1的表达受油菜素内酯抑制,Gh NAC2和Gh NAC3受低浓度油菜素内酯的表达诱导,油菜素内酯能够影响Gh NAC的表达响应干旱胁迫。     

陆地棉无短绒突变体GZnn的纤维发育及其基因表达分析

 【目的】利用棉花无短绒突变体GZnn为材料，分离与棉花纤维发育相关的重要基因，从而揭示棉花纤维发育的分子机理。【方法】通过扫描电镜观察GZnn与其近等基因系TM-1在纤维发育上的差别;采用差异显示RT-PCR方法寻找GZnn与TM-1之间的差异表达片段，并进行相应分析。【结果】用扫描电镜观察突变体GZnn与TM-1的胚珠表面纤维细胞起始发生的情况，发现GZnn不仅在纤维细胞发生和延伸上延迟，而且纤维细胞总数也明显减少。利用差异显示PCR进行比较筛选，获得了12个差异表达的EST片段，其中，DS3只特异性地在GZnn 开花前（-3～0 DPA）的胚珠中特异表达，而在其近等基因系TM-1中没有表达，推测DS3可能是一个纤维启动过程中的MYB类负调控转录因子。【结论】本研究利用棉花无短绒突变体GZnn发现，棉纤维细胞在早期分化和形态建成过程中大量基因表达，对其中的关键基因的表达模式和功能开展深入研究将有助于阐明棉纤维分化发育的分子机理，为棉花遗传改良提供理论基础。     

植物激素对棉花Ligon lintless纤维突变体的调控影响

以棉花野生型及突变体Ligon lintless为试材,研究不同种类和浓度的植物生长物质对大田棉株及胚珠离体培养后,胚珠或愈伤组织中GA、IAA、ABA、ZR等含量的影响。结果表明:经F、IAA、GA、ABA、BR处理后,离体胚珠IAA、GA、ABA、ZR的含量均高于对照;突变体和野生型胚珠在0DPA和+1DPA时的发育情况无差异,第1批纤维均在0DPA起始,+3DPA时,野生型胚珠表面的纤维较突变体长,两者第2批纤维均在+5DPA时突起。     

植物激素对棉花Ligonlintless纤维突变体的调控影响

以棉花野生型及突变体Ligon lintless为试材，研究不同种类和浓度的植物生长物质对大田棉株及胚珠离体培养后，胚珠或愈伤组织中GA、IAA、ABA、ZR等含量的影响。结果表明：经F、IAA、GA、ABA、BR处理后，离体胚珠IAA、GA、ABA、ZR的含量均高于对照；突变体和野生型胚珠在0DPA和＋1DPA时的发育情况无差异，第1批纤维均在0DPA起始，＋3DPA时，野生型胚珠表面的纤维较突变体长，两者第2批纤维均在＋5DPA时突起。     

棉花热激转录因子GhHsf基因的表达及其烟草转化

【目的】了解棉花Gh Hsf基因的功能,分析该基因的表达模式,构建其植物表达载体并转化烟草获得转基因植株。【方法】利用半定量RT-PCR对棉花热激转录因子基因Gh Hsf的表达模式进行分析。构建p CAMBIA1301-Gh Hsf植物表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草,并进行鉴定。【结果】棉花Gh Hsf基因在棉花各组织中为组成型表达;构建Gh Hsf基因植物表达载体p CAMBIA1301-Gh Hsf,转化烟草获得了转基因植株。【结论】棉花Gh Hsf基因在棉花的不同组织中是组成型表达,获得了转Gh Hsf基因烟草株,为进一步开展功能研究奠定基础。     

棉花纤维发育相关转录因子的研究进展

棉花纤维细胞分化和发育是1个极其复杂的过程，在纤维发育的各个时期均有大量基因参与调控，相关转录因子在棉纤维发育过程中起着极其重要的作用。介绍了近年来研究较多的棉纤维发育相关转录因子MYB类转录因子、MADS类转录因子和SPB类转录因子等的概况以及最新的研究进展，可为棉花转录因子的研究提供参考。     

棉纤维起始分化期基因枪介导的GhSuSy表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase)通过调节植物糖代谢介导棉纤维的起始和发育。为进一步研究棉纤维起始分化过程中蔗糖合酶的转录调控机制,克隆了GhSuSy基因5'端上游2 000 bp的启动子片段,构建了含LUC荧光报告基因的重组载体,采用基因枪瞬时转化技术,把重组载体DNA分别转化到棉花叶片和花瓣,比较分析了不同载体膜压力、不同轰击距离与孵育时间等条件下的荧光素酶(luciferase,LUC)活性。用优化后的条件检测了棉纤维起始分化期蔗糖合酶基因GhSuSy偶联的LUC在叶片和花瓣中的活性,并与GhSuSy表达、蔗糖合酶活性比较分析。结果显示:-0.09 MPa真空度下,可裂膜压力设为6.80 MPa,载体膜距离叶片7 cm,轰击2次转化效率最高,转化后样品孵育16 h左右LUC荧光信号最强;与叶片中LUC表达相比,花瓣中LUC荧光信号强、活性高,特别是开花当天(0 d)和开花后1 d(1 DPA)差异明显;在纤维起始分化的开花前3 d(-3 DPA)到开花后3 d(3 DPA),叶片和花瓣中LUC活性先升高后降低,在0和1 DPA的LUC活性最高,这一结果与GhSuSy的定量分析、蔗糖合酶活性检测结果趋于一致,同时纤维起始时期胚珠中GhSuSy的表达和蔗糖合酶活性也显著升高。这些结果暗示GhSuSy基因或编码的蔗糖合酶在0和1 DPA可能调控了棉纤维的起始和分化,表明基因枪介导的瞬时转化系统可用于进一步的GhSuSy基因启动子转录调控分析。     

棉花GhGT-2转录因子的克隆及其功能分析

【目的】棉花是重要的纤维作物,其生长常遭受非生物逆境危害,严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能,为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对,从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因,通过基因序列分析,发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板,根据EST序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析,并构建同源物种间系统进化树,通过SMART网站(http://smart.emblheidelberg.de/)进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料,在棉花15 d苗龄时(一对真叶期),分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h,然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d(12 days post anthesis,DPA)纤维等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221,和GAL4 DNA结合结构域载体,在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验(EMSA)检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1 579 bp,开放阅读框为1 428 bp,编码475个氨基酸的蛋白,推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD,等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明,GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d(12 DPA)纤维中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低。在冷胁迫下,GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外,在1、6和12 h的表达量均低于0 h,呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下,GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h,但3、6和12 h的表达量均高于0 h,表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析,GhGT-2主要定位于细胞核中,转录激活活性不明显。凝胶阻滞(EMSA)分析发现,GhGT-2可以结合GT元件GT2-Box、GT3-Box、GT-1b(BoxⅡ)和MYB元件MBS1、MRE1、MRE3、MRE4。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列,其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域,属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下,GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

棉花油菜素类固醇合成酶基因GhDWF1的克隆和表达分析

 【目的】研究油菜素类固醇物质（BRs）在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合，从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1 849 bp，包含一个1 692 bp的开放阅读框，推导编码563个氨基酸，与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性，具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强，在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比，无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。     

Cloning and Expression Analysis of a Brassinosteroid Biosynthetic Enzyme Gene, GhDWF1, from Cotton （Gossypium hirsuturm L.）

Brassinosteroids （BRs） are an important class of plant steroidal hormones that are essential in a wide variety of physiological processes. To determine the effects of BRs on the development of cotton fibers, through screening cotton fiber EST database and contigging the candidate ESTs, a key gene （GhDWF1） involved in the upstream biosynthetic pathway of BRs was cloned from developing fibers of upland cotton （Gossypium hirsutum L.） cv. Xuzhou 142. The full length of the cloned cDNA is 1 849 bp, including a 37 bp 5＇-untranslated region, an ORF of 1 692 bp, and a 120 bp 3＇-untranslated region. The cDNA encodes a polypeptide of 563 amino acid residues with a predicted molecular mass of 65 kD. The deduced amino acid sequence has high homology with the BR biosynthetic enzyme, DWARF1/DIMINUTO, from rice, maize, pea, tomato, and Arabidopsis. Furthermore, the typical conserved structures, such as the transmembrane domain, the FAD- dependent oxidase domain, and the FAD-binding site, are present in the GhDWF1 protein. The Southern blot indicated that the GhDWF1 gene is a single copy in upland cotton genome. RT-PCR analysis revealed that the highest level of GhDWF1 expression was detected in 0 DPA （day post anthesis） ovule （with fibers） while the lowest level was observed in cotyledon. The GhDWF1 gene presents high expression levels in root, young stem, and fiber, especially, at the fiber developmental stage of secondary cell wall accumulation. Moreover, the expression level was higher in ovules （with fibers） of wildtype （Xuzhou 142） than in ovules of fuzzless-lintless mutant at the same developmental stages （0 and 4 DPA）. The results suggest that the GhDWF1 gene plays a crucial role in fiber development.     

棉花GhSPS1的克隆及表达模式分析

【目的】克隆棉花蔗糖磷酸合成酶基因(sucrose-phosphate synthase,SPS),并分析该基因在组织和纤维发育不同阶段及不同非生物胁迫下的表达模式。【方法】采用genome-walking及over-lap PCR方法,获得了棉花中一个蔗糖磷酸合成酶基因——GhSPS1,通过半定量PCR法检测GhSPS1在不同非生物胁迫条件下的表达模式,采用实时荧光定量PCR法对GhSPS1及GhSUS3、GhINV、GhCESA4进行组织和纤维发育特异性表达分析。【结果】克隆得到的GhSPS1全长4 545 bp,包含10个内含子、11个外显子,其开放读码框为3 108 bp,编码1 035个氨基酸,且该基因在ABA、低温处理条件下表达量增加,在高温胁迫下,表达量先升高后降低。实时荧光定量PCR结果显示,GhSPS1及GhSUS3在各种组织中都有表达,其中,在0 DAF、3 DAF的胚珠及18 DAF的纤维中表达量最高,而GhINV、GhCESA4则分别在3—15 DAF的纤维、18 DAF的纤维中表达量最高。【结论】克隆得到的GhSPS1属于SPSA基因家族,能参与ABA、低温、高温等非生物胁迫应答,且可能在纤维发育的起始期及次生壁增厚初期发挥作用。     

Molecular Identification and Expression Analysis of GhHYDRA 1 Gene,a Homologue of HYDRA1 Gene From Upland Cotton （Gossypium hirsutum L.）

Beside as precursors of BRs biosynthesis,more and more evidences supposed that phytosterols play an important role in plant growth and development.To investigate the effects of phytosterols on the fiber development of upland cotton(Gossypium hirsutum L.)and the molecular base of sterol regulating cotton fiber growth,a homologue of HYDRA1 was cloned from upland cotton(cv.Xuzhou 142)by screening cotton fiber EST database and contigging the candidate ESTs.The GhHYDRA1 encoded a polypeptide of 218 amino acid residues and the deduced amino acid sequences had high homology with the members of HYDRA1 in Populus trichocarpa,Solanum tuberosum,and Arabidopsis thaliana.Moreover,GhHYDRA1 had comparable transmembrane regions to AtHYDRA1 in sequence,length,order,and spacing,except for a C-terminal polylysine cluster.Quantitative real-time RT-PCR analysis revealed that the higher expression levels of GhHYDRA1 gene were detected in 6 to 12 DPA(days post anthesis)fibers,while the lower levels were observed in 0 DPA ovule(with fibers)and 16 to 18 DPA fibers.These results indicated that GhHYDRA1 is the homologue of HYDRA1 gene and plays a crucial role in fiber elongation.Furthermore,auxin and BL up-regulated the expression level of GhHYDRA1 while ABA and KT down-regulated the expression level of GhHYDRA1 in cotton ovule and fiber growth.The result suggested that phytosterols play a role in the interaction of plant hormones.     

彩色棉纤维发育的特性研究

棕色和绿色纤维中的色素可用HNO3/乙醇提取,提取液中的色素含量可在412 nm波长下根据吸收值的大小进行估计.在开花后15 d前后,棕色和绿色纤维中的色素已经形成和积累,并在开花后20 d色素含量达到最高值. 棕色纤维颜色发生明显加深的时期是开花后30～35 d,棕色纤维的颜色较稳定,在阳光下甚至有加深的趋势.绿色棉纤维在开花后20 d时纤维出现绿色,之后随着纤维的发育颜色逐渐加深,但在阳光下易退色.在棕色和绿色纤维中纤维素含量明显低于白色纤维,可能是由色素物质的积累所引起.在开花后15～30 d期间,白色纤维细胞的pH值呈快速下降趋势,但棕色和绿色纤维细胞的pH值下降速度比白色纤维细胞明显要慢,在这一时期pH值下降速度的快慢可能与纤维的伸长、次生壁的加厚和色素的形成有关.与白色纤维比较,棕色和绿色纤维品质较差,如:长度偏短,强度偏低,本文对其可能原因进行了探讨.     

花青素代谢对陆地棉叶片和纤维色泽呈现的影响

【目的】棉花作为一种重要的经济作物和油料作物,其叶片和纤维均可积累色素物质,呈现不同颜色。叶绿素、类胡萝卜素和花青素的含量及其比例是棉花叶片呈色的主要原因,而棕色纤维中主要色素成分为花青素单体氧化聚合而成的原花青素及其衍生物。通过分析陆地棉不同的叶色突变体叶片和纤维中的花青素含量,花青素和原花青素合成途径中关键基因的表达,探究棉花叶片和纤维颜色呈现与花青素合成的关系,为叶色突变体的利用和彩色棉纤维色泽的改良奠定基础。【方法】通过测定21个陆地棉叶色突变体的叶片花青素含量,根据叶色突变体叶片、纤维颜色和花青素含量差异,筛选了其中6个典型的棉花叶色突变体作为研究材料,比较叶片和纤维（开花后15 d）中的花青素含量,分析花青素含量与叶片、纤维颜色呈现的关系;同时检测叶片及不同发育时期纤维（开花后5、10、15和20 d）中花青素合成关键基因GhCHS和原花青素合成途径关键基因GhLAR和GhANR的表达水平,分析目标基因对叶片和纤维颜色呈现的影响。【结果】21个陆地棉叶色突变体叶片中的花青素含量差异显著,呈现紫红色或紫色的叶片花青素含量高。在筛选的6个陆地棉叶色突变体及其对照叶片和不同发育时期纤维中,叶片花青素含量显著高于纤维,棕色纤维的花青素含量显著高于白色纤维。叶片中,GhCHS表达量较高,而GhANR和GhLAR表达量较低,花青素积累与颜色呈现与其表达量没有显著的相关性;而在纤维中,GhANR和GhLAR在棕色纤维的表达量极显著高于白色纤维中,且主要集中在纤维发育的5—15 DPA高表达。【结论】陆地棉叶片和纤维的颜色呈现均与花青素含量有关,紫色及紫红色叶片以及棕色纤维中花青素含量高,但纤维颜色的形成与棉花叶片颜色呈现没有显著的相关性,其花青素含量与原花青素合成途径的关键基因GhANR和GhLAR表达水平直接相关,表明棉花叶片和纤维中的呈色机制不一致,原花青素主要在纤维中积累显色。     

受精对胚珠离体培养棉纤维生长发育的影响分析

【目的】探索了新疆陆地棉品种新陆早36号未受精胚珠(0 DPA)和受精胚珠(2 DPA)在离体条件下棉纤维的生长发育情况。【方法】利用胚珠离体培养技术分别不继代培养未受精胚珠和受精胚珠30 d,通过纤维长度测量和生长图像的数字化处理技术,对二者体外培养12 DPA和27 DPA的生长状况进行对比分析。【结果】12 DPA时,未受精胚珠纤维长度为0.8 cm,纤维团面积为0.28 cm2,分别为受精胚珠的67%和54%;27 DPA时,未受精胚珠纤维长度为1.7 cm,纤维团面积为0.85 cm2,分别为受精胚珠的81%和77%。【结论】发现受精胚珠在不同时期的纤维发育情况均明显好于未受精胚珠,受精胚珠建立的离体培养体系更适合用于棉纤维生长发育过程的研究。     

海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析

[目的]海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析。[方法]利用RT-PCR技术,从海岛棉中克隆CONSTANS(CO)的同源基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因的组织表达。[结果]从新海14号花后9 d的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO。GbCO eDNA的ORF为1 008 bp,编码335个氨基酸。序列分析表明GbCO和GhCO的相似性只有78.2%,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近。qRT-PCR结果表明,GbCO基因在棉花的根、茎、叶、花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高。并且GbCO在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1 d和开花后5 d的胚珠中表达量很高。GbCO基因的表达受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天。[结论]GbCO基因可能在陆地棉的开花发育中起着重要的作用。