苏云金芽孢杆菌外孢囊蛋白基因敲除载体的构建

以苏云金芽孢杆菌(Bt)库斯塔克亚种(subsp.kurstaki) 8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt8010的外孢囊蛋白基因上下游序列,以含有卡那基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含外孢囊蛋白基因上游序列、卡那基因、外孢囊蛋白基因下游序列的基因敲除载体pRN5101UKD,为后续...     

雄性不育基因barnase对西瓜的遗传转化

将带有雄性不育基因、除草剂基因及卡那霉素抗性基因的质粒pBI-TBSbar通过冻融法导入根癌农杆菌菌株LBA4404中,采用农杆菌介导法转化西瓜品种(京欣一号,亲本自交系C-1),获得具有卡那霉素抗性植株8株,PCR,Southern blot检测表明,外源片段已经整合到西瓜基因组中.     

大肠杆菌诺氟沙星超敏感多基因敲除株KYAH06构建与功能验证

以E. coli DH5α为出发菌株采用pKD46质粒提供λRed重组系统完成以下三步基因敲除：大肠杆菌中RND超家族多药物抗性蛋白acrAB基因并借助其与pKD3质粒的氯霉素抗性片段同源重组被敲除；大肠杆菌中MATE家族多药物抗性蛋白ydhE基因通过卡那霉素抗性筛选和蔗糖反向筛选被无痕敲除；大肠杆菌中主要负责诺氟沙星外排的MFS超家族转运蛋白mdtH基因通过与pK18mobSacB质粒中的抗性片段的同源重组被敲除。以上基因敲除不同程度导致大肠杆菌对诺氟沙星的敏感性变化，最终获得诺氟沙星敏感性为0.0125μg·mL^-1的E. coli KYAH06，为大肠杆菌MdtH详细转运机制以及其他诺氟沙星外排转运蛋白鉴定和功能分析奠定试验基础。     

纳豆芽孢杆菌rocG基因和ure基因敲除载体的构建

rocG基因和ure基因分别编码纳豆芽孢杆菌中2个与产氨相关的酶--谷氨酸脱氢酶编码和尿素酶。为构建这2个基因的敲除载体,通过PCR分别获得了2个靶基因的上下游旁邻片段和抗性筛选基因nisI。将上游旁邻片段、nisI和下游旁邻片段按次序克隆到革兰氏阳性菌基因组整合质粒pMUTIN4中。限制性内切酶酶切图谱分析及测序结果显示成功构建了纳豆芽孢杆菌rocG基因和ut＇e基因的敲除载体pMUTIN4-rocG：nisI和pMUTIN4-“M：：nisI。该质粒的构建,为同源重组获得低产氨纳豆芽孢杆菌工程菌株奠定了基础。     

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。     

嗜线虫致病杆菌YL001 cpxR基因敲除突变株的构建及其抑菌活性研究

【目的】通过同源重组技术敲除嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001中cpxR基因,为进一步研究CpxR调节子调控抗菌物质产生的机理奠定基础。【方法】通过融合PCR技术,将cpxR基因的上、下游同源片段及质粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3个片段连接,克隆到自杀载体pDM4中,将重组质粒转化到大肠杆菌S17-1λpir中,经接合转移导入嗜线虫致病杆菌内,通过同源重组敲除cpxR基因;采用琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法分别测定突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用。【结果】从X.nematophila YL001基因组中成功敲除cpxR基因,得到了ΔcpxR突变菌株;ΔcpxR突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用较野生菌株分别提高了1.4和1.7倍。【结论】CpxR负向调控嗜线虫致病杆菌YL001抗菌物质的产生。     

菊花转抗虫基因植株的PCR快速鉴定

对经过卡那霉素抗性筛选所得到的菊花转苏云金芽胞杆菌毒蛋白Bt基因和转雪花莲外源凝集素GNA基因所得的抗性植株 ,利用改良SDS法提取菊花DNA ,然后利用NPTII引物对 6个菊花品种的抗性植株所提DNA进行PCR扩增 ,发现了符合NPTII基因片段大小的亮带 ,初步证实获得了转Bt基因和转GNA基因的菊花植株。     

产志贺毒素大肠杆菌毒素基因的敲除

根据GenBank上致仔猪水肿病大肠杆菌志贺毒素(Stx2e)A单位基因序列(M21534)以及Red重组系统试剂盒提供的FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列设计1对引物;引物的5′端与Stx2e基因同源,3′端与FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列同源。使用合成的引物利用PCR扩增FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列片段。将扩增的PCR片段转化带有pRedET重组质粒的产志贺毒素大肠杆菌(STEC)S451521菌株(F18+)的感受态细胞中,通过同源重组技术替换Stx2eA单位基因的805～1 152bp区域。通过卡那霉素抗性以及PCR检测获得同源重组的STEC后,将708-FLPe质粒进一步转化重组菌,利用Flp重组酶去除了重组菌的卡那霉素抗性。另外,研究还发现Stx2e基因在STEC基因组中并非单拷贝。     

枯草芽孢杆菌3610 ClpQY基因缺失突变株的构建及其功能

为了验证枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中Clp QY基因的功能,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR扩增出Clp QY基因上下游同源序列840 bp和983 bp的片段,并与自杀质粒p MAD载体连接,构建重组质粒p MADup-down,运用化学转化法通过枯草芽孢杆菌菌株PY79,采用LOOP IN和LOOP OUT的方法,获得不带抗性,且Clp QY完全敲除的枯草芽孢杆菌3610菌株。产孢试验表明,该基因在芽孢生成中为非必需基因,而在生物膜的形成过程中具有调节作用。高温生长试验显示,该基因对细胞逆境条件下的生长存在一定的调控功能。     

腊样芽胞杆菌DNF409中硝酸盐还原酶基因敲除的研究

在腊样芽胞杆菌DNF409中,narGHJI基因负责编码呼吸过程中硝酸盐还原酶基因nar的α、β、γ、ζ、四个亚基.通过基因同源重组的方法,利用一段带有终止序列和Ω环的链霉素抗性片段,取代nar中的部分基因片段,实现硝酸盐还原酶的基因敲除,从而得到专一降解亚硝酸盐的突变体菌株.其硝酸盐还原酶的活性降低了80%.该菌与DNF409共同使用,可解除DNF409单独使用时亚硝酸盐严重积累的现象.     

枯草芽孢杆菌224 yplQ基因敲除及其对溶血性的影响

为了确定枯草芽孢杆菌224(Bacillus subtilis 224,BS224)的溶血基因或引起溶血的主效基因,以枯草芽孢杆菌224基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增yplQ基因上游约1.0 kb和yplQ基因下游0.5 kb两段DNA序列,并以携带新霉素抗性基因的重组质粒pMD18-T-neo为骨架,构建基于yplQ基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yplQ,线性化后电转化至枯草芽孢杆菌224,通过新霉素抗性平板得到36个neor抗性转化子,基因组PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定yplQ18为yplQ基因缺失菌株,将其接种到5%的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测,仍能引起溶血。结果表明,单独敲除枯草芽孢杆菌224染色体上yplQ基因对菌株的溶血性无影响或影响不大。     

木薯一个假定的NBS类抗病基因的获得及其功能分析

根据已克隆植物NBS类抗病基因的保守结构域设计一对简并引物．以抗细菌性枯萎病木薯种质E1340基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得大小约0．5kb的产物。该产物克隆、测序后比对木薯基因组数据库,分别获取其上下游各1．7kb和2．0kb的序列,进行基因预测。预测结果表明,扩增到的序列位于一个预测基因内,该基因命名为SNBl。序列分析表明,该基因编码986aa,具有NBS类抗病基因的结构特征,是一个假定的抗病基因,可能在木薯抗细菌性枯萎病过程中发挥重要作用。     

肺炎克雷伯菌药物外排泵mdtl的克隆及分析

[目的]探讨肺炎克雷伯菌ATCC 49790（KP）耐药的分子机制。[方法]以KP基因组DNA为模板来扩增mdtl基因,将mdtl基因扩增产物进行DNA测序及同源性分析;将扩增产物与载体连接后转化到大肠埃希菌KAM32感受态细胞中,对转化子进行药敏分析。[结果]KP的mdtl基因扩增产物与已报道的mdtl基因核苷酸序列同源性达到99%,这个转化子对红霉素、氯霉素和卡那霉素具有很高的耐药性,这种高耐药性能被外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙和维拉帕米逆转。[结论]克隆到了KP一多药外排基因。     

过敏反应促进蛋白基因hrap转马铃薯的研究

利用根癌农杆菌介导法,将由甜椒中分离出的一种过敏反应促进蛋白hrap基因导入马铃薯品种"Russet Burbank"和"大西洋"中。转化再生植株经过含卡那霉素培养基的生根筛选、PCR检测、Southern杂交鉴定表明目的基因已导入马铃薯品种中,RT-PCR检测结果表明目的基因已整合到马铃薯DNA中并表达。通过对转基因植株进行活体接种抗病性检测,获得了抗晚疫病和抗青枯病的植株。     

Hematotoxicity in workers exposed to low levels of benzene

Benzene is known to have toxic effects on the blood and bone marrow, but its impact at levels below the U.S. occupational standard of 1 part per million (ppm) remains uncertain. In a study of 250 workers exposed to benzene, white blood cell and platelet counts were significantly lower than in 140 controls, even for exposure below 1 ppm in air. Progenitor cell colony formation significantly declined with increasing benzene exposure and was more sensitive to the effects of benzene than was the number of mature blood cells. Two genetic variants in key metabolizing enzymes, myeloperoxidase and NAD(P)H:quinone oxidoreductase, influenced susceptibility to benzene hematotoxicity. Thus, hematotoxicity from exposure to benzene occurred at air levels of 1 ppm or less and may be particularly evident among genetically susceptible subpopulations.     

番茄匍柄霉SlCmr1基因克隆及其敲除载体的构建

【目的】克隆番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）SlCmr1基因,并构建SlCmr1基因敲除载体,为研究该基因功能打下基础。【方法】根据NCBI数据库提供的番茄匍柄霉基因组信息设计引物,PCR扩增得到SlCmr1基因的DNA全长和CDS序列,并对SlCmr1基因编码的蛋白进行生物信息学分析。利用SlCmr1基因上、下游1100 bp左右的序列设计引物,分别PCR扩增SlCmr1基因的上、下游片段,通过酶切连接的方法将SlCmr1基因的上、下游序列分别插入载体pCX62,构建SlCmr1基因敲除载体。【结果】SlCmr1基因的DNA全长为3275 bp,CDS长度为3018 bp,有3个内含子,编码蛋白序列全长1005 aa,分子式为C₄₈₈₂H₇₆₄₂N₁₄₀₄O₁₄₉₉S₆₁,分子量为111.94 kD,理论等电点为（pI）6.64,半衰期30 h,不稳定指数58.72,亲/疏水性平均值为-0.424,预测亚细胞定位于细胞核,存在2个相邻的ZnF_C2H2结构域和1个GAL4结构域,推测SlCMR1为不含跨膜区域的非分泌、不稳定可溶性蛋白。分别将SlCmr1基因上、下游序列插入pCX62载体,成功构建了基因敲除载体pCX62-SlCmr1。【结论】SlCmr1可能是真菌调控色素合成的关键基因,在真菌的次级代谢产物合成中发挥重要作用。     

棉花NBS抗病基因的发掘

根据已克隆的R基因的保守序列设计引物,在棉花不同抗性品种中克隆出500 bp左右大小片段,克隆测序并在NCBI上进行Blast分析,发现这些序列除一个序列外均与已经克隆的抗病基因类似物(RGAs)同源,且同源性高达98%以上。将这些从棉花中克隆的RGAs和植物中已克隆的几个典型的R基因序列建立进化树,棉花中的RGAs序列分别聚在3个不同的亚家族,可以通过后续的功能验证来确定这些序列片段的功能。     

酿酒酵母 ERG6基因缺失突变株的构建

设计含有与ERG6基因两侧序列同源的长引物,以质粒pBlue-Kan为模板进行PCR扩增,构建含有Cre/lox P系统的酿酒酵母ERG6基因敲除组件.将基因敲除组件转化至酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)AD1-8,通过同源重组的方式使目的基因缺失,获得为lox P-Kan-lox P序列组件所替换而产生Kanr的阳性克隆子.然后再将质粒pHis-Cre转入阳性克隆子表达Cre重组酶敲除筛选标记,成功获得酿酒酵母ERG6基因缺失的突变株,并命名为AD1-8-δ.