对虾白斑综合征病毒(WSSV)致病相关基因研究进展

介绍了最近几年白斑综合征病毒WSSV致病相关基因的研究进展,包括病毒囊膜蛋白基因、核衣壳蛋白基因、病毒复制过程的关键酶基因、细胞因子受体基因、潜伏相关基因和抑制宿主细胞凋亡机制的基因等。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP26和VP28的原核表达及多克隆抗体的制备

对虾白斑综合征病毒(WSSV)是一种能快速繁殖并且传播的致死病原体,在全球范围威胁虾蟹的生存.它感染的宿主范围很广,不仅侵染各种野生及养殖对虾,而且侵染其他水生甲壳类如蟹类、螯虾和龙虾等.VP28、VP26是WSSV病毒粒子的2个主要囊膜蛋白.本试验成功构建了其原核表达体系,制备了多克隆抗体,为进一步研究对虾白斑综合征病防治措施的免疫试验提供抗体和依据.     

淡水养殖凡纳滨对虾IHHNV-WSSV共感染率调查分析及其对免疫相关酶活性的影响

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)均为需向OIE报告的虾类病毒,本研究于2014年对上海地区部分淡水养殖凡纳滨对虾WSSV和IHHNV的感染及共感染情况进行了跟踪、检测和人工感染分析。检测结果显示,WSSV和IHHNV平均单感染率分别为42.6%和38.5%,双病毒共感染率为20.5%,其中,IHHNV-WSSV共感染率与WSSV感染率呈正相关。病理和累计死亡率分析显示,尽管IHHNV-WSSV组的对虾累计死亡率比同一时间点WSSV组低,但是这两组濒死对虾鳃丝细胞的病变都很严重,病变程度无明显差异。免疫相关酶——超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶活性分析表明,IHHNV-WSSV共感染可以在一定程度上比单纯WSSV感染激起更高和更快些的免疫应答,但是,随着感染时间的延长,IHHNV-WSSV共感染表现出比WSSV单感染更长时间的免疫抑制。研究表明,虽然IHHNV-WSSV共感染可在一定时间范围和一定程度内降低对虾累计死亡率,但是共感染可造成病毒致病性的叠加和宿主更长时间的免疫保护低下,因此,IHHNV-WSSV共感染导致的损失可能比单病毒感染更大。     

用核酸探针技术检测脊尾白虾体内的白斑综合症病毒

用斑点杂交和原位杂交检测了从病虾池捕获的脊尾白虾体内的WSSV。8尾脊尾白虾的斑点杂交检测阳性率为100%;脊尾白虾胃的上皮组织和结缔组织、位于鳃区头胸甲处的角化上皮、头胞甲反缘与虾体相连的角化上皮、结缔组织、附肢外的角化上皮、鳃丝的柱状上皮及其腔隙内的血淋巴、肝胰腺小管间的上皮组织及其血窦内的血淋巴、头胸甲的肌肉、造血组织、脊尾白虾精荚之结缔组织细胞、卵巢的结缔组织及其滤泡细胞原位杂交呈阳性。以上结果进一步证实了脊尾白虾是WSSV的天然宿主。     

白斑综合征病毒（WSSV）感染淡水枝角类的初步研究

采用WSSV发病对虾组织碎块投喂、WSSV粗提液投浸、WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌和酵母菌投喂对淡水枝角类进行白斑综合征病毒（WSSV）攻毒,然后将攻毒前后的淡水枝角类进行PCR检测。结果表明,投喂WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌可以感染淡水枝角类。     

对虾白斑综合征病毒结构蛋白的研究概况

白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）是严重危害对虾养殖业的病原之一。随着WSSV基因组全序列的公布及蛋白质组学的飞速发展,对WSSV结构蛋白及其相互作用的研究越来越深入。通过对WSSV结构蛋白及其相互作用的分析,进一步研究其在病毒感染过程中的作用,这为有效控制甚至阻断WSSV感染奠定基础。     

蠕虫逃避宿主防御攻击的机制述评

根据近年来有关蠕虫对宿主的耐受性的研究结果，综合评述了蠕虫逃避宿主防御攻击的机制，它包括：对宿主独特信号的接收机制、降解宿主抗体机制、消灭反应性氧中介物机制。指出蠕虫在宿主中的防御机制及其功能性成分对畜禽蠕虫病预防和治疗新方法的开发具有重要意义。     

白斑综合征病毒与凡纳滨对虾肠道菌群区系之间关系的初步研究

比较了同一养殖池中的感染白斑综合征病毒(WSSV)和未感染WSSV的凡纳滨对虾的肠道菌群,旨在探讨对虾肠道菌群与机体健康状态之间的关系。感染WSSV对虾肠道的细菌总数为1.06×106CFU/尾,显著高于未感染WSSV的对虾(1.78×105CFU/尾;P<0.05),且其肠道中的细菌分别属于弧菌属、气单胞菌属、海水球菌属、盐水球菌属和乳酸杆菌属;染WSSV的对虾(P<0.05),气单胞菌的比例显著的低于感染WSSV的对虾(P<0.05);盐球菌所占的比例两者之间差异不显著。结果显示,两种对虾在肠道菌群组成和细菌组成和细菌数量上存在显著的差异,初步表明对虾肠道菌群区系和机体的健康状态密切相关。     

VP28蛋白鸡源抗WSSV卵黄抗体的制备及性能分析

为了研制鸡源抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）卵黄抗体（IgY）,利用WSSV毒株及其衣壳蛋白VP28制备成2种不同的疫苗,并分别免疫接种健康蛋鸡群,使鸡群产生不同的IgY,经病毒中和试验证实,2种IgY均有明显的抗WSSV效果,其中WSSV粗提液1∶1000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY对南美白对虾的保护率为61.7%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为48.3%;而WSSV粗提液1∶10000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为85.0%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为75.0%.     

白斑综合征病毒广西株缺失区基因的比较分析

为了解广西养殖凡纳滨对虾中白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的感染流行情况,并探讨WSSV广西株缺失区ORF23/24基因的遗传进化差异及其与各地WSSV毒株间的遗传进化关系,2010年5月至2013年9月在广西凡纳滨对虾主产区北海、钦州和防城港共采集306份患病虾样品,应用世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式聚合酶链式反应(nested-PCR)方法进行WSSV检测;选取第一轮PCR为阳性的53份样品进行缺失区ORF23/24基因的PCR扩增,并将12份阳性PCR产物进行克隆、序列测定与比较分析。结果显示:306份患病虾样品中有82份为WSSV感染阳性,阳性率为26.8%;12株WSSV广西株缺失区ORF23/24基因大小均为2 096 bp,相对于此区域最为完整的WSSV-TW株,广西株均在中间缺失了10 970 bp;12株WSSV广西株的缺失区ORF23/24基因差异小,核苷酸同源性均在99.6%以上,仅存在少数碱基的替换,没有缺失和插入,其中BH-3、QZ-1、FCG-1和FCG-2的核苷酸序列完全一致;基于缺失区构建的系统发育进化树显示,WSSV广西地方株在遗传上相距较近,全部与印度株IN-05-Ⅰ聚在一个大的分支,而与台湾株、中国株及韩国株在遗传上相距较远。研究表明,WSSV感染在广西凡纳滨对虾主要养殖地区存在一定程度的流行;广西WSSV毒株缺失区ORF23/24基因的变异类型为中间大片段缺失,各毒株间无明显的地域和时间差异;WSSV广西株与印度株IN-05-Ⅰ的遗传进化关系最近。     

真核表达载体pcDNA3.1（＋）-vp28的构建及其在细胞中的表达

[目的]为研究对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白与虾细胞之间的作用机制奠定基础。[方法]采用PCR扩增方法构建含白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28的真核表达重组载体pcDNA3.1（＋）-vp28,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒转染到293T细胞中,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。[结果]VP28的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现出1条634bp左右的条带,与GenBank中vp28的序列完全一致。对pcDNA3.1（＋）-vp28转染后的阳性单克隆菌落进行PCR鉴定、扩大培养和质粒提取,并对所得质粒进行HindⅢ和BamⅢ双酶切,获得了5409和610bp左右的2条带,与预期结果一致;所获扩增产物与vp28序列完全一致,说明重组质粒pcDNA3.1（＋）-vp28被成功转染到293T细胞中;SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中的表达产物与预期结果相符。[结论]pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中可成功表达VP28。     

凡纳滨对虾ATG6基因克隆及其在WSSV感染中的表达

[目的]克隆获得凡纳滨对虾自噬相关基因Lv ATG6 cDNA全长,揭示其组织表达特征及其在白斑综合症病毒(WSSV)感染后的表达变化。[方法]利用PCR方法克隆Lv ATG6,半定量PCR方法检测Lv ATG6在对虾10种组织中的表达情况及WSSV侵染后Lv ATG6在对虾鳃和肝胰脏2种组织中的基因表达变化。[结果]克隆获得Lv ATG6 cDNA全长1 275 bp,编码424个氨基酸,预测蛋白分子量大小为51.5 k D;Lv ATG6基因在凡纳滨对虾10种组织中均有表达,无组织表达特异性;Lv ATG6在病毒感染不同时间的对虾鳃和肝胰脏组织中均出现明显的表达变化。[结论]凡纳滨对虾Lv ATG6及参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用,该研究为深入揭示凡纳滨对虾细胞自噬与WSSV病毒作用关系奠定了基础。     

对虾白斑综合征病毒射阳株的分离及其在螯虾体内的动态分布

从江苏射阳某对虾养殖场采集患白斑综合征的病死对虾，以对虾组织镁浆液接种克氏原螯虾并传至2代。结果螯虾全部发病死亡。用斑点杂交和单抗ELISA检测对虾和2代螯虾，均为白斑综合征病毒（WSSV）阳性，将此WSSV命名为射阳株，进一步用斑点杂交和单抗ELISA检测射阳株在肌注和口服感染螯虾体内的动态分布，并与青岛株的动态分布相比较。口服和肌注螯虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中检出，然后减少，36h后又明显检出，并增加至高峰然后减少；肠上皮、心脏、肌肉中的病毒在口服和肌注感染后36h同时出现并呈总体递增分布；此外，病毒在胃上皮、真皮和结缔组织中也有不同程度的分布。感染死亡螯虾各主要组织器官均可检出病毒；电镜观察死亡螯虾鳃、心脏、肝胰腺、直皮、卵巢等器官的超薄切片，均可见到典型的病毒粒子，显示死亡螯虾内病毒已形成周血感染。WSSV射阳株与青岛株在螯虾的动态分布具有相似性。     

白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

对虾白斑综合症病毒综述

对虾白斑综合症病毒（W SSV）是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。W SSV是一种无包涵体的杆状病毒,PCR诊断技术具有简便快速、灵敏度高等优点,适合于大规模检测。对W SSV的分子生物学进行深入研究,优化现有的检测技术,积极探索新的检测方法,有效防止W SSV感染产生的危害,以促进对虾养殖业的发展。