白粉菌诱导的中国野生毛葡萄抑制消减文库构建及EST序列分析

【目的】构建白粉菌诱导下中国野生毛葡萄"商-24"的抑制消减文库,获得抗白粉病差异表达基因EST序列。【方法】应用抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建白粉菌诱导下高抗白粉病的中国野生毛葡萄"商-24"叶片SSH-cDNA文库,通过生物信息学方法对文库中的EST序列进行分析。【结果】成功构建了白粉菌诱导的中国野生毛葡萄"商-24"抑制消减cDNA文库,对消减文库测序后获得了200个EST序列,大小为300～1000bp;BLAST分析表明,其中19个EST序列与已知功能基因序列同源性很高,分别参与了植物的防卫反应、胁迫反应、细胞解毒和信号转导等。【结论】获得了葡萄抗白粉病的EST序列,这为进一步克隆抗葡萄白粉病基因、探明其抗病分子机理奠定了基础。     

粗山羊草（Ae.tauschii）幼苗和根全长cDNA文库构建及其EST注释与比较分析

 【目的】构建小麦D基因组供体粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，探讨利用生物信息学方法分析发掘组织特异性表达基因的可行性。【方法】本研究利用Cap-trapper方法构建全长cDNA文库，利用高通量测序技术获得大批高质量EST序列，在基于Linux系统的本地化生物信息学分析平台上对上述EST进行了电子注释分析。【结果】成功构建了粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，测序获得根EST序列6 973条和叶EST 6 616条。利用本地化数据分析平台对其进行功能注释。利用GO-Diff软件，发现了两个文库间表达基因的功能差异，找到组织间表达差异显著的基因和组织内特异性表达的基因。【结论】利用构建的全长cDNA测序获得大量EST序列，通过生物信息学方法挖掘差异表达或特异性表达基因的方法是可行的。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序，发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因，为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料，利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列，采用生物信息分析手段，对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库，该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1，平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆，获得5 233条高质量表达序列标签（EST），序列拼接出3 922个单一基因；同源比对分析表明，89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性，这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能；并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库；大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

蓝塘猪和大白猪消减cDNA文库与差异基因分析

 【目的】寻找肉质性状候选优势表达基因，研究猪肉质优良性状的遗传基础和分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建蓝塘猪和大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库，利用实时荧光定量PCR法研究基因的差异表达。【结果】获得61个有效克隆。对整个文库进行测序分析，获得47条有效序列。用BLAST在线软件与GenBank 和GenBank EST等数据库进行同源序列比较，发现其中有2条未知序列。对文库中所包含的MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3、HUMMLC2B、GNTN和Oaz等基因进行了实时荧光定量PCR检测，结果显示MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3和HUMMLC2B这5个基因在蓝塘猪肌肉组织的表达量显著高于大白猪（P＜0.05）；GNTN和Oaz基因在大白猪肌肉组织中的表达量显著高于蓝塘猪（P＜0.05）。【结论】很多EST与肉质有关的重要基因具有很高的同源性，这些基因在蓝塘猪和大白猪中表达差异显著（P＜0.05）。     

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建甘蔗根系全长cDNA文库，并进行测序，为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础。【方法】在干旱胁迫条件下，以新台糖22号甘蔗根系为材料，采用SMART技术构建cDNA文库，并进行EST序列分析。【结果】文库构建质量鉴定结果显示，文库库容量为1.0×106 PFU/mL，重组率约95%，文库插入片段长度在 500～2000 bp，平均长度约1102.1 bp。挑选526个阳性克隆进行单向测序后，共获得 523个ESTs序列，去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后，进行聚类分析并组装，共得到468个Uni-ESTs，其中congtig 29个，singlets 439个，分别占总数的6.5%和93.5％。通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对，发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列，占94.87%；获得24个未知蛋白功能基因，占5.13%。【结论】构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库，获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs，并获得一批新的未知蛋白功能基因。     

葡萄感白粉病基因的RAPD标记及其序列分析

【目的】为葡萄抗白粉病育种的辅助选择提供理论依据。【方法】以抗病的中国野生葡萄白河-35-1与感病的欧洲葡萄佳利酿杂交亲本及其F1、F2代为试材,通过对520个随机引物的筛选,从佳利酿中获得了葡萄感白粉病基因的RAPD标记OPV06-1100,并在欧洲葡萄、中国野生华东葡萄和美洲野生葡萄中进行了分析验证。【结果】经克隆、测序,RAPD标记OPV06-1100实际长度为1 016 bp。该标记与欧洲葡萄黄酮醇合成酶基因有92%的同源性,与13条欧洲葡萄叶片非生物胁迫数据库的EST序列有89%~97%的同源性;与3条来自欧洲葡萄感染葡萄皮尔斯病原菌后转录反应获得的EST序列有93%~95%的同源性;与拟南芥感白粉病基因PMR6序列有27.1%的同源性。【结论】OPV06-1100为葡萄属植物感白粉病基因的RAPD标记。该标记为认识葡萄感病基因和基因组以及标记辅助育种奠定基础。     

C57BL/6和A/J两品系小鼠脾脏消减cDNA文库的构建及差异基因分析

【目的】检测健康C57BL/6和A/J小鼠常规免疫指标，构建脾脏消减cDNA文库并筛选差异表达基因，以探讨两品系小鼠对猪链球菌抗病性差异的分子机制。【方法】利用ELISA法检测血清常规免疫指标，抑制性消减杂交（suppression subtraction hybridization，SSH）技术构建8周龄小鼠脾脏差异表达基因的cDNA文库。【结果】试验结果表明，A/J品系小鼠血清中IgA水平明显高于C57BL/6品系小鼠（P＜0.05），而血清IgG和IFN水平在两品系小鼠间均无显著差异。对筛选的149个阳性克隆进行测序，去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后获得56条差异表达序列标签（ESTs）。利用Genebank的BLAST分析核酸和蛋白质同源性比较，26个不同的基因或ESTs具有高度的同源性，2条ESTs未找到同源序列。【结论】筛选到很多EST与信号转导、细胞凋亡及免疫等重要功能基因高度同源，为研究猪链球菌的致病机理和防治提供了实验依据。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

小麦叶锈菌与TcLr19非亲和互作cDNA文库的EST分析

 【目的】建立小麦叶锈菌与小麦非亲和互作的基因表达数据库,为从分子水平阐明小麦抗叶锈病机制奠定基础。【方法】对叶锈菌诱导的TcLr19小麦叶片cDNA文库随机测序,利用BLASTx对所得序列进行功能注释,按照Bevan的植物基因功能分类标准进行分类。采用RT-PCR技术,以Actin为参照,对2条信号转导相关基因和3条抗病与防御相关基因进行表达分析。【结果】随机对cDNA文库中756个阳性克隆测序,获得649条高质量EST。对EST序列聚类拼接获得472条非重复序列(Unisequence)。功能分类结果表明,25.2%为未知功能蛋白,21.0%与能量代谢基因相关,17.8%与抗病防御基因及信号转导基因相关,其余EST分别与转录、转运、蛋白代谢等功能基因相关。RT-PCR分析结果表明同一基因在叶锈菌侵染后不同时间点的小麦叶片中表达量不一致,且各基因有不同的表达模式。【结论】推测钙转运ATP酶,谷胱甘肽-S-转移酶,蛋白激酶Pti1,NBS-LRR抗病蛋白和分子伴侣DnaJ等参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。该cDNA文库可用于了解小麦与叶锈菌非亲和互作过程中的功能基因,为建立研究病原菌基因及小麦抗病基因数据库奠定基础。     

中国野生葡萄白粉菌诱导cDNA文库中抗病基因的筛选

【目的】从中国野生华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因。【方法】根据植物抗病基因保守序列NBS位点设计特异引物,对葡萄白粉病接种诱导后的环化cDNA文库进行菌落PCR筛选,从随机挑选的大量菌落中筛选出82个PCR阳性菌落,提取阳性菌落的质粒进一步进行PCR检测确认,对确认的36个阳性质粒插入片段进行了测序。【结果】测序结果和序列生物信息学分析结果均表明,有3个基因序列与Genbank中的已知序列有较高的同源性,其中1个基因序列与葡萄抗白粉病基因(DT661587.1)序列同源性达99%,另外2个基因序列与水分胁迫下葡萄特异表达基因(DT031657.1)和葡萄抗皮尔斯病基因(CF202948.1)的同源性分别为89%和96%。【结论】初步推测获得的3个基因均为抗性相关基因。     

应用抑制性差减杂交技术筛选锦橙CTV应答基因

【目的】探讨易感柑橘衰退病病毒（Citrus tristeza virus,CTV）品种锦橙CTV应答分子机理,筛选和分析CTV应答基因。【方法】以嫁接CTV强毒株TRL514的锦橙阳性材料叶片为试验方（Tester）,用嫁接无毒枝条的CTV阴性锦橙叶片为驱动方（Driver）,构建CTV侵染的锦橙的正向差减文库。【结果】随机挑选850个阳性克隆测序,其中742条测序成功,去除载体片段和接头序列后得到有效EST 692条。将所有EST序列对应到柑橘的预测基因组转录物,共涉及137个柑橘基因。应用BLAST2GO对这些特异性表达的基因进行功能归类和KEGG分析。结果表明,受CTV侵染的影响,锦橙能量代谢相关基因上调明显,与光合器官碳固定、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢等途径相关的EST出现频率较高。另外,与抗逆防御以及苯基丙氨酸合成、类苯基丙烷代谢、类胡萝卜素合成等与植物防御素类物质合成密切相关的代谢途径相关基因较多。【结论】由于CTV的侵染,CTV易感品种锦橙基础代谢改变明显,须通过增强能量代谢和提高自身防御能力来维持自身生长和发育。     

短枝型苹果SSH文库构建及相关基因表达分析

【目的】寻找苹果短枝型枝条形成相关基因,为进一步探索苹果短枝型芽变形成机理及选育新的短枝型苹果品种奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术构建正反向苹果短枝型芽变枝条和正常型枝条差异表达cDNA文库,利用荧光定量RT-PCR验证文库中克隆的插入片段。【结果】从两个文库中共获得291个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在300—600 bp之间。利用GenBank的BLAST比对分析,其中126个表达序列标签（EST）找到了与之匹配的同源序列。获得的cDNA片段功能涉及代谢、转录、胁迫响应、转运、光合和信号转导;有165个EST片段未找到同源序列。对文库中EST序列进行实时荧光定量RT-PCR验证,结果显示这些EST序列在短枝型芽变枝条与正常型枝条之间差异性表达。【结论】通过构建短枝型苹果正反向文库,得到一些与短枝型苹果枝条节间长度相关联的基因,这些基因可能对短枝型苹果枝条的伸长具有一定作用。     

茄子温敏单性结实抑制差减文库的构建与分析

 【目的】构建茄子单性结实差减文库，分离获得茄子单性结实相关基因，研究茄子单性结实形成的分子机制。【方法】以茄子单性结实品系D-10低温条件下无籽的子房和果实，以及适温条件下有籽的子房和果实为材料，采用抑制差减杂交（SSH）技术构建正向和反向差减文库。对阳性克隆测序、BLAST比对分析、GO（gene ontology）功能注释及分类和荧光定量PCR分析。【结果】正反向文库共获得了2 347个阳性克隆；测序、序列拼接后，共获得1 248个高质量的unigenes；将其与非冗余数据库BLAST比对后，有1 109个unigenes找到同源序列，139个unigenes无同源序列为新基因。1 248个unigenes中527个在GO数据库中有功能注释，其中细胞组分、分子功能和生物过程的unigenes分别为206、445和361条，分析表明，茄子单性结实果实的差异主要发生在细胞内部，单性结实性状的表达可能受到一些因子和激酶的调控。【结论】成功构建了茄子单性结实不同时期果实的抑制差减文库，获得3个可能与茄子单性结实相关的unigenes，包括MADS-box基因、雌蕊伸展相关蛋白和果实膨大相关基因。     

梨小食心虫滞育与非滞育幼虫抑制性消减文库的构建与分析

【目的】分离和鉴定梨小食心虫（Grapholita molesta（Busck））滞育相关基因。【方法】分别以梨小食心虫滞育和非滞育幼虫为材料，通过抑制性消减杂交技术（SSH），构建梨小食心虫滞育与非滞育正、反向差减cDNA文库，从中筛选梨小食心虫滞育相关基因，并对其进行测序和分析。【结果】在获得的128个滞育特异和132个非滞育特异的EST中，有滞育差异表达EST 42条（17条功能未知）、非滞育差异表达EST 46条（22条功能未知）。对差异表达EST同源检索后推测，其功能大部分与滞育或非滞育特性相关。在滞育个体中，代谢酶和滞育关联蛋白基因表达量较高；在非滞育个体中，贮存蛋白和信号传递基因表达量较高。【结论】这些EST基本反映了梨小食心虫在滞育与非滞育期间的基因表达谱，为今后深入研究梨小食心虫滞育的分子机理奠定了基础。     

黄瓜基因组中抗霜霉病候选基因的生物信息学及其表达特异性

【目的】寻找黄瓜抗霜霉病基因,研究黄瓜抗霜霉病机制。【方法】利用拟南芥和甜瓜抗霜霉病蛋白质序列,搜索黄瓜基因组数据库;通过生物信息学分析候选基因特征,以黄瓜抗霜霉病自交系M801-3-1为试材,分析候选基因在叶片组织中的表达状态。【结果】共获得187个黄瓜抗霜霉病候选基因;确定了候选基因染色体位置和排列特点、序列相似性特征以及系统进化关系;大部分黄瓜R基因在未接种霜霉病菌的抗病自交系和感病叶片组织中都有一定的表达量,在接种霜霉病菌后在抗病自交系M801-3-1中Csa001907和Csa002921表达量下调,感病自交系M302-3 中Csa001907和Csa002921变化不明显。【结论】在黄瓜基因组中存在185个与拟南芥抗霜霉病基因同源的R基因,2个与甜瓜的抗霜霉病基因At1和At2同源的eR基因,通过聚类分析这些基因可以分为6类,初步认定Csa001907和Csa002921为黄瓜抗霜霉病的R基因,这2个基因在叶片组织中有一定表达量,其表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的抗病反应。     

环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫(Theileria annulata)可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞(即非转化宿主细胞)为试验材料,提取总RNA和m RNA,反转录合成c DNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交(SSH),构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签(ESTs)364条,大小主要分布在350—1 200 bp之间;将这些ESTs序列在Gen Bank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条(其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列)和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程(biological process)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。     

利用SSH技术鉴定黄瓜胚胎发育相关基因

【目的】寻找黄瓜胚胎发育早期和胚胎发育晚期优势表达基因,研究其胚胎发育的分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建胚胎发育早期和晚期差异表达cDNA文库。【结果】经反向Northernblot杂交检测,共得到97个阳性克隆。利用分子生物学软件对测序后的序列进行质量检测和聚类、拼接,共得到93个UniESTs,其中包括86个singletons和7个contigs。将上述EST序列在GenBank上进行BLAST比对,有83个EST片段找到了与之匹配的同源序列,有10个EST片段未找到同源序列,推测可能是新基因。【结论】其中很多EST与拟南芥、水稻或玉米蛋白质数据库中的热激蛋白具有很高的同源性。将以上序列应用GeneOntology进行功能分类,发现在胚胎发育早期细胞防御和代谢过程占主要位置;在胚胎发育晚期细胞防御和抗渗透胁迫功能是非常重要的。     

基于BSA-Seq技术的甜瓜抗霜霉病InDel标记开发

目的 获得与甜瓜抗霜霉病基因连锁的分子标记或功能标记,用于甜瓜分子标记辅助选择育种。为进一步克隆甜瓜抗霜霉病主效基因奠定基础。方法 以野生高抗霜霉病资源DM-4和感病自交系DM-2为亲本,构建F₂代分离群体,利用BSA-seq对甜瓜抗霜霉基因进行QTL定位,开发InDel分子标记,并在双亲及其F₂群体单株进行筛选验证。结果 甜瓜抗霜霉病主效QTL位于第9号染色体。在候选区间开发了37个InDel分子标记,有9个PCR产物大小在抗、感双亲表现出差异,用F₂单株验证,结合田间表型鉴定结果,引物InDel 15和InDel 20准确率分别为95 %和98 %,引物InDel 15和InDel 20在抗病亲本中扩增产物大小分别为251和349 bp,在感病亲本中分别为231和324 bp。结论 引物InDel 15和InDel 20可以作为分子标记进行抗霜霉病辅助选育,加快了甜瓜抗霜霉病育种速度。