瘤胃微生物基因组文库中BAC末端序列分析

基于前期从瘤胃微生物基因组文库中筛选的功能酶克隆菌,利用T7和pIBRP引物,测定功能酶克隆菌的BAC末端序列,并利用NCBI Blast系统对BAC末端序列进行分析.结果表明:共得到26条BAC末端序列,经Blast比对分析,与已知编码基因的匹配度低,而大部分BAC末端序列与阪崎肠杆菌和环境中的微生物匹配度高,说明瘤胃中的微生物与其它环境中的微生物具有一定的相似性,进一步丰富了对瘤胃微生物的认识.     

奶牛瘤胃微生物元基因组文库中二肽基肽酶Ⅳ的筛选与分析

【目的】研究奶牛瘤胃内参与蛋白质降解过程中二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidases Ⅳ,DPP-Ⅳ）的序列特征和酶学性质。【方法】从奶牛瘤胃微生物Fosmid文库中挑选17 664个克隆,利用dpp-Ⅳ简并引物筛选含dpp-Ⅳ的阳性克隆。提取阳性克隆的质粒,用限制性内切酶Hind Ⅲ进行酶切。PCR扩增含dpp-Ⅳ目的片段,并克隆测序。对阳性克隆的Fosmid末端进行测序。提取阳性克隆粗酶液,利用底物Gly-Pro-pNA检测肽酶活性。【结果】筛选后获得10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆（命名为DP1—DP10）。Fosmid末端序列经BLASTX比对后发现78%的序列可以与数据库的已知序列相匹配,但相似度变化较大（44%—94%）。DPP-Ⅳ序列经BioEdit比对后,发现均含有N端保守区域（DWVYEEE）和C端催化区域（GWSYGG）,经BLASTP比对发现阳性克隆的DPP-Ⅳ分别与Cyclobacterium marinum（43%）、Capnocytophaga sp.（63%）、Prevotella ruminicola 23（66%）和Solitalea canadensis（50%）的DPP-Ⅳ相似度高。酶活力检测发现DP7肽酶活力最高,为6.88 U•mg-1。【结论】从瘤胃微生物Fosmid文库中获得了10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆,它们具有不同的dpp-Ⅳ序列特征和肽酶活性。     

独龙牛瘤胃细菌纤维素酶基因克隆

【目的】从分子生物学水平对独龙牛的瘤胃纤维素酶基因资源进行筛选及酶学特性研究,为后续开发利用新的纤维素酶提供参考依据,也为揭示瘤胃微生物降解纤维素的作用机理打下基础。【方法】提取独龙牛瘤胃微生物中的大片段基因组DNA,构建瘤胃微生物基因组文库,并进行纤维素酶活性筛选,筛选获得的高活性基因经测序后进行生物信息学分析与酶学性质研究。【结果】从独龙牛瘤胃中共获得20352个阳性克隆,白斑率达92%,构建的瘤胃微生物基因组文库容量899.6 Mb,空载率1.82%。从瘤胃微生物基因组文库筛选获得2个具有纤维素酶活性的阳性克隆(B1和B2),其中,B1基因序列长1230 bp,编码409个氨基酸,基因编码产物与来自Ruminococcus albus纤维素酶基因编码产物(β-1,4-内切葡聚糖酶,Gen Bank登录号P23661.1)的覆盖率高达99%,其同源性高达97%;B2基因序列长1002bp,编码333个氨基酸,基因编码产物与Uncultured microorganism纤维素酶基因编码产物(纤维糊精酶,Gen Bank登录号ADB80112.1)的覆盖率高达99%,其同源性为83%。B1和B2基因可在Rosetta原核表达宿主菌中成功诱导表达,B1纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40℃;B2纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40~50℃。【结论】从构建的独龙牛瘤胃微生物基因文库中筛选获得2株具有较高活力的纤维素酶(B1和B2),其中,B1为β-1,4-内切葡聚糖酶,而B2为新的纤维糊精酶,可为纤维素的体外降解提供新型材料。     

奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析

 【目的】从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选含乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因的克隆子,并对其全长测序和生物信息学分析。【方法】利用PCR序列驱动筛选法,从瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因,鸟枪法测定基因序列后,进行基因注释、比对和系统发育分析。【结果】筛选得到了含ACCase基因的克隆(U12),其插入片段序列(URE12)全长43 358 bp,GC含量为43.75%,经GeneMark程序预测含有38个基因,经Signature程序预测属于变形菌门。ACCase基因(Acc-32)编码159个氨基酸,与Elusimicrobium minutum的ACCase基因具有41%的相似度,编码蛋白分子量为17.89 kD,等电点为5.27,在距离Acc-32上游的33 kb区域,发现一段能编码ACCase连接酶的基因。Acc-32的结合位点氨基酸残基为GQVICVIEAMKVFNELKA,系统发育分析表明Acc-32属于ε-变形菌纲。【结论】得到了含有ACCase基因的序列片段,并且ACCase基因具有新的结构特征。     

黄淮白山羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建与分析

采用CTAB法和蛋白酶K法提取黄淮白山羊瘤胃微生物总DNA,酶切获得DNA片段,大小为23～50 kb,以E.coli EPI300为宿主细胞,构建瘤胃微生物宏基因Fosmid文库。研究发现该文库共获得克隆28 800个,插入片段大小约35 kb,空载率小于2%,容量1 008 Mb。通过羧甲基纤维素酶和木聚糖酶(Xylanase)活性筛选,分别获得具有两种酶活性的阳性克隆60和32个,木聚糖酶和羧甲基纤维素酶(CMC,Carboxymethyl cellulase)共同作用阳性克隆15个。通过已测序MF3木聚糖酶阳性克隆酶学活性分析,该木聚糖酶在最适应pH 4.5, 40℃条件下,酶活力为79.287μ·mL~(-1)。为进一步研究黄淮白山羊瘤胃内纤维素酶(Cellulase)基因奠定基础。     

宏基因组学方法分析奶牛瘤胃尿素分解菌的多样性

利用脲酶保守序列ureC引物和细菌16S rDNA通用引物PCR扩增并测序,揭示奶牛瘤胃尿素分解菌的多样性。提取本研究室前期鉴定的16个脲酶克隆的质粒,利用脲酶保守序列ureC引物和细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增,将PCR产物连接到pMD19-T载体,转化E.coliJM109,挑取阳性克隆测序。利用Blast程序将序列与GenBank和RDP数据库进行比对,并使用Mega 4.0软件构建系统发育树。4个脲酶克隆含有脲酶保守序列ureC,系统发育树分析表明,U1、U5、U13和U15分别属于Firmicutes、ε-Proteobacteria、β-Proteobacteria和Actinobacteria;7个脲酶克隆含有16S rDNA,经过建树分析,U1、U3、U7、U10、U11、U12和U14分别属于Staphylococcus、Shigella、Bacillus、Acinetobacter、Achromobacter、未培养微生物和Bacillales。实验结果显示,奶牛瘤胃微生物脲酶基因和尿素分解菌具有多样性的特点。     

大白菜抗霜霉病同源基因的筛选与亚克隆文库的构建

根据植物抗霜霉病基因保守区设计简并引物,利用三维PCR方法对大白菜(Brassica campestris ssp.pekiensis)‘85-1'BAC文库进行筛选,从19 200个BAC克隆中筛选到含有目的基因的10个阳性克隆.利用HindⅡ对其中的94一G-17克隆进行酶切,回收1～5 kb的DNA片段并连接到载...     

利用BAC克隆混合型探针筛选中国美利奴细毛羊cDNA文库

采用Taq酶进行快速标记细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)克隆酶切片段,对制备好的混合型探针进行检测。通过噬菌体原位杂交的方法,筛选中国美利奴细毛羊cDNA文库。结果杂交筛选获得了3个cDNA阳性克隆,经过测序比对,分析了主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)基因的组成。     

水稻基因组文库的构建及YR-DNA的筛选

为了克隆决定染色体形成的特异DNA片段YR-DNA,以λExCell为载体,克隆经限制性内切酶EcoRI消化后的水稻基因组DNA,λ噬菌体体外包装构建了滴度为1.2×106 pfu/ml,重组效率达86%的小型水稻基因组文库.随机选取了50个重组克隆,质粒释放后进行酶切鉴定,插入序列的大小为0.5～7 kb,平均为3 kb.以水稻基因组DNA为探针对基因组DNA文库进行筛选,从10 000个重组子中选出200个杂交信号较强的阳性克隆,质粒释放后点渍杂交进行第2轮筛选,从中选取40个杂交信号较强的重组子,再次进行斑点杂交,选取10个杂交信号最强的重组子.酶切并回收基因组插入片段,标记特异的重组片段,与不同酶切后的水稻基因组DNA进行Southern杂交,其中有两个探针杂交后基因组酶切带上杂交信号呈弥散状,表明重组片段为散在重复序列.     

肠道微生物宏基因组文库构建及酯解酶基因筛选

利用宏基因组学方法,以人肠道微生物样品为原材料,构建了1个约30 000个克隆的fosmid文库.以三丁酸甘油酯为底物,通过功能筛选,获得1个酯解酶阳性克隆.对该阳性克隆构建亚克隆,挑选具有酯解酶活性的阳性亚克隆进行测序分析,最终获得1个肠道微生物来源的酯解酶基因(GenBank登录号:JQ972699).结果表明,文库克隆的平均插入片段约为40 kb,没有重复插入片段克隆.获得的酯解酶基因推演蛋白与Pyramidobacter piscolens W5455的patatin样磷脂酶同源性最高,氨基酸一致性为95％.生物信息学分析结果表明该基因可能通过Vd型分泌方式进行分泌并发挥功能.本研究是通过构建人肠道微生物宏基因组大片段文库并结合重组子功能筛选获得酯解酶的首次报道,可为食品工业提供新的酯解酶来源和筛选方法.     

Web2.0,以个人为中心的互联网时代的到来

本文介绍了Web2．0的知识和背景，对Web2．0出现的基础以及典型技术和应用作了阐述，同时对其作出了前景展望。     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。     

小菜蛾阿维菌素和虫酰肼抗性品系对几种新型药剂的交互抗性研究

以敏感品系为对照,利用室内筛选获得的虫酰肼和阿维菌素高抗品系Teb-R和Aba-R,测定了小菜蛾对几种新型杀虫剂的交互抗性。结果发现:小菜蛾对虫酰肼产生高水平抗性后(抗性倍数185.5倍),对阿维菌素表现出中等水平交互抗性(41.0倍),对茚虫威(11.4倍)和溴虫腈(5.3倍)仅表现出低水平交互抗性,对多杀菌素(1.7倍)和氯虫苯甲酰胺(1.4倍)则没有表现出明显的交互抗性。用阿维菌素筛选Teb-R品系39代后获得阿维菌素高抗品系Aba-R(593.8倍),该品系对茚虫威(12.3倍)表现出中等水平交互抗性,对多杀菌素(7.9倍)表现出低水平交互抗性,对溴虫腈(2.7倍)和氯虫苯甲酰胺(0.9倍)的交互抗性不明显;同时该品系对虫酰肼的抗性也由阿维菌素筛选前的185.5倍下降到筛选后的28.0倍,也没有交互抗性。基于上述研究结果认为,使用虫酰肼防治小菜蛾出现抗性后,可以使用多杀菌素和氯虫苯甲酰胺进行替代防治,但不宜用阿维菌素、茚虫威和溴虫腈进行替代防治;利用阿维菌素防治小菜蛾产生抗性后,可以用溴虫腈、氯虫苯甲酰胺和虫酰肼进行替代防治,但不宜用多杀菌素和茚虫威。     

市级综合气象信息分析与管理系统的设计与实现

以抚顺地区3个国家基本站50余年气象资料为依托，采用Microsoft Excel工作表实现由气候和农业气候2部分构成的气象与农业综合信息处理系统的基本思路、方法、内容、用途和使用情况。为了实现气候分析及应用的科学化、客观化、系统化、规范化、程序化及连续化的业务目标，按业务流程设计与实现的，包括资料处理、气候趋势模拟、气候预测、气候鉴定、季节性信息化处理、农作物产量预报、气候生产潜力分析等一系列内容在内的系统建设。关键是解决了大量的计算问题，建立了区域性通用模式。     

断根与打顶对番茄嫁接愈合的抑制作用

【目的】断根嫁接苗和打顶双干或多干嫁接苗日益广泛用于番茄栽培,丰产作用显著。了解断根与打顶对番茄嫁接愈合的作用机制,可为番茄嫁接生产提供理论依据。【方法】以‘硬粉8号’为接穗品种,‘砧爱1号’为砧木品种,观测断根和打顶后番茄嫁接愈合进程、成活率和木质部连通性等,同时测定嫁接接合部生长素和细胞分裂素的含量及愈合相关基因的表达。【结果】断根和打顶抑制了嫁接接合部上方木质部分化基因VND7的表达,并显著延迟了木质部的重构。断根显著降低了嫁接后12和72 h接合部玉米素核苷（tZR）和反式玉米素（tZ）的含量,以及嫁接后12 h接合部吲哚-3-乙酸（IAA）,吲哚-3-乙酸甲酯（ME-IAA）和吲哚-3-甲醛（ICAld）的含量;打顶嫁接后12 h接合部IAA和ME-IAA含量显著低于对照和断根处理,下调了嫁接后3和12 h接合部上方和下方韧皮部分化相关基因NEN4表达水平。断根或打顶均下调了嫁接后3—48 h接合部上方细胞分裂相关基因Histone H4和SlcycB1-4的表达水平;断根和打顶同时处理使嫁接接合部IAA和ME-IAA含量显著低于断根处理,使tZR和tZ的含量及木质部连通性显著低于打顶处理。打顶和断根后分别在嫁接接合部施用10 mmol∙L^-1 IAA和10 mmol∙L^-1 6-BA可显著促进嫁接苗木质部的重构。【结论】断根和打顶分别降低接合部细胞分裂素和生长素积累,下调愈合相关基因表达,降低木质部输导能力,进而延缓番茄嫁接愈合进程。     

鱼池水中钾钠的火焰原子发射光谱分析

本文研究了用火焰原子发射光谱法分析鱼池水中钾钠的方法。对方法精密度、回收率和共存元素的干扰进行了考察。建立了最佳测试条件。表明本方法简易、快速、准确。它亦适用对天然水中钾钠的测定。     

锌、锰、铜对大蒜吸收硒的影响

本试验通过盆栽大蒜探讨土壤施硒、锌、锰、铜对大蒜吸收这些元素以及这些元素之间的相互影响。结果表明,随着土壤施硒量的增加,土壤中硒的有效含量增加,大蒜地上部和地下部含硒量也增加;土壤施锌、锰、铜对大蒜吸收硒几乎没有影响;而硒会明显地抑制大蒜对锌元素的吸收,对锰、铜的吸收虽有抑制但只在地下部明显,因此,土壤施硒的量一定要合适。     

离子铵和非离子氨对海蜇螅状幼体和碟状幼体的毒性研究

在温度（２０±１）℃，盐度２２￣２４‰条件下，对海蜇螅状幼体和碟状幼体进行了ｐＨ适应性试验和不同ｐＨ下氨氮的急性毒性试验，结果表明：适合海蜇螅状幼体和碟状幼体生活的ｐＨ范围为７￣９，最适ｐＨ范围为７．５￣８．５，在此ｐＨ范围内，不仅非离子氨具有毒性，离子铵在浓度高时亦具有毒性。对于螅状幼体，此毒性倍数约为１１７￣２２０。