草鱼肠道抗菌肽的提取及体外抑菌效果初步研究

将新鲜草鱼肠道组织经超声破碎、乙酸浸提后,再经Sephadex G50和Sephadex G25 凝胶柱过滤层析,收集各组分,采用药敏纸片法检测各组分的抗菌活性.收集具有抗菌活性的组分,经Tricine SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色后分析获得1条较明显的蛋白带,相对分子质量约为6 200.该抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌均表现出较强的抗菌活性,说明抗菌肽对维持鱼类肠道微生物区系稳定具有重要作用.     

肠道损伤对草鱼胆固醇代谢通路基因表达的影响

[目的]有研究显示草鱼肠道健康与胆固醇代谢具有较为紧密的关系,本研究探讨草鱼肠道损伤对胆固醇合成代谢通路基因表达的影响.[方法]以池塘养殖条件下的草鱼为研究对象,在对肠道损伤进行外观形态、组织切片和血清指标评估的基础上,测定了草鱼血清中的甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆汁酸(TBA)和总胆固醇(TC)含量,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,定量检测肠道和肝胰脏组织的胆固醇、胆汁酸生物合成酶和调节控制酶的基因表达水平的变化.[结果]肠道损伤的草鱼血清HDL、LDL、TC和TBA的含量显著下降(P<0.05),肝胰脏和肠道组织的胆固醇、胆汁酸合成酶相关基因表达水平极显著上调(P＜0.01),与此同时,负调控胆汁酸合成的法尼醇X受体FXR和调控胆固醇逆转运途经的血浆胆固醇酯转移蛋白CETP基因表达水平极显著下调(P＜0.01).[结论]草鱼肠道损伤后,胆固醇、胆汁酸的重吸收可能遭到破坏,刺激了肝胰脏和肠道的胆固醇、胆汁酸生物合成强度,从而维持胆固醇在机体内的代谢平衡.     

娄底地区鱼类肠道微生物与酶活性的初步研究

研究采用微生物传统选择培养法和比色法对娄底地区的草鱼、鲫鱼、鲢鱼和鳙鱼4种鱼肠道的微生物数量和酶活性进行测定,以期为娄底地区鱼类疾病的防治、微生物添加剂的使用提供资料。结果显示:草鱼肠道中真菌、肠球菌和大肠杆菌数量最多,鲫鱼肠道内的优势菌群为乳酸菌,而鲢鱼和鳙鱼肠道内不存在优势菌群;草鱼肠道内纤维素酶和淀粉酶活性较高,鲫鱼肠道内蛋白酶和脂肪酶活性较高,鲢鱼和鳙鱼肠道酶活性表现中规中矩,纤维素酶和淀粉酶活性低于草鱼,蛋白酶和脂肪酶活性低于鲫鱼。分析认为,在健康状态下,鱼类肠道微生物数量和酶活性与其食性存在一定的对应关系。     

复合微生物制剂对草鱼生长与消化酶活性的影响

以"正大康"草鱼颗粒饲料配方为基础日粮,将1%的复合微生物制荆作为饲料添加剂投喂草鱼,30 d后分别测定草鱼的生长性能指标与肝胰脏、肠道的淀粉酶和脂肪酶的活性.结果显示,实验组草鱼的体重和体长分别比对照增长8.93%(P＜0.01)和3.93%(P＜0.01);肝胰脏和肠道的淀粉酶的活性分别提高227.36%(P＜0.01)和239.56%(P＜0.01),脂肪酶的活力分别提高22.51%(P＜0.01)和7.16%(P＜0.01).从而表明,复合微生物制剂能有效促进草鱼的生长与提高消化能力,为其在水产养殖中的应用提供参考依据.     

群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群结构的影响

[目的]揭示群体感应淬灭作用与宿主肠道菌群结构间的作用关系,为具有群体感应淬灭作用益生菌及其淬灭酶在水产养殖上的推广应用提供理论依据.[方法]选取30尾规格为25±1 g/尾的草鱼随机分为对照组和试验组,试验组每尾草鱼腹腔注射100μL溶解稀释后的YtnP(25μg/mL),对照组每尾草鱼腹腔注射等量的300 mmol/L分子筛缓冲液,分别在注射后24和48 h采集草鱼前肠、中肠和后肠的肠道组织及内容物,提取各肠段总DNA及PCR扩增16S rRNA序列V3~V4可变区,然后基于Illumina MiSeq高通量测序技术分析外源添加YtnP对草鱼肠道菌群多样性与丰度的影响.[结果]12份草鱼肠道样品测序共获得原始序列(Raw reads)660205条,有效序列(Valid reads)416614条;对照组和试验组样品的OTU数目分别为142±102和143±67个.在门分类水平上,对照组和试验组草鱼肠道优势菌群均为放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes);相对于对照组,试验组草鱼肠道中浮霉菌门(Planctomycetes)相对丰度显著增加(P<0.05,下同),放线菌门、梭杆菌门和变形菌门的相对丰度也呈升高趋势,但差异不显著(P>0.05,下同),厚壁菌门、TM7和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度则呈下降趋势.在属分类水平上,对照组和试验组草鱼肠道均以鲸杆菌属(Cetobacterium)和诺卡氏菌属(Nocardia)为优势菌群;相对于对照组,试验组草鱼肠道中鲸杆菌属相对丰度呈升高趋势、诺卡氏菌属相对丰度呈下降趋势,但变化差异均不显著,未特指微杆菌属(Unspecified_Microbacteriaceae)相对丰度则显著增加.草鱼肠道菌群结构Alpha多样性分析发现,试验组样品的Chao1和ACE指数低于对照组样品,Shannon和Simpson指数略高于对照组样品,但差异均不显著;Beta多样性分析结果显示,对照组与试验组间的菌群特点存在差异,且组间区分效果明显.[结论]外源添加YtnP不会导致草鱼肠道优势菌群种类发生明显变化,但能在一定程度影响肠道菌群的相对丰度.     

枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌肽的提取及其应用

为了提取枯草芽孢杆菌抗菌肽以探索其对食品的防腐效果,选用枯草芽孢杆菌DZSY21、解淀粉芽孢杆菌FZB42和枯草芽孢杆菌OKB105 菌种发酵,然后将这3个菌种的发酵上清液分别与丙酮按1:2的体积比混合,旋转蒸发浓缩得到3种菌的抗菌肽粗提物。对抗菌肽的热稳定性试验可知3种菌的抗菌肽经100 ℃加热30 min后抑菌效果均有小幅度降低,但抑菌活性仍较强。抗菌肽蛋白酶稳定性试验结果显示,3种菌的抗菌肽对胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都很敏感;应用性试验中采用牛奶、苹果、肉等作为食品模型,结果显示经枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌肽处理后的试验组品相均明显好于对照组。表明枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌肽具有较好的防腐效果。     

草鱼肠道正常菌群与肠炎病原菌关系的初步研究

本文运用微生态学原理和方法,对二龄健康草鱼和肠炎草鱼肠道中的大肠杆菌、肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌四种优势常居菌及草鱼肠炎病原菌——点状产气单胞菌进行了定量检测。同时,对草鱼肠道中厌氧菌和需氧菌比值也进行了测算。通过对试验数据的统计学处理分析,阐明了点状产气单胞菌与肠道正常菌群的量变关系,提出了两个回归计算式。另外,还从微生态学角度,对草鱼肠炎的发病机理和生物防治进行了讨论。     

草鱼肠道粘膜细胞的分离与原代培养

以强化培育后草鱼的肠道粘膜为试验材料,采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团,分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果,并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程,同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果。结果表明:采用机械刮取消化法,分离转速为400 r/min,在使用M199培养液、6%CO2、15%胎牛血清、接种浓度为2×103(个/孔)条件下可批量复制草鱼原代肠道粘膜上皮细胞;细胞增殖过程符合动物原代肠道粘膜上皮细胞生长分化规律,采用荧光倒置显微镜与Giemsa染色法相结合、MTT检测法、AKP酶活力及LDH/MTT OD值可系统评价细胞培养效果。     

肠道菌群与草鱼个体大小相关性研究

[目的]探讨草鱼肠道菌群与草鱼个体大小之间的相关性。[方法]采用DGGE方法对同一批孵化并在同一池塘中养殖的个体大小显著差异的草鱼肠道样品进行分析。[结果]无论大个体草鱼还是小个体草鱼,其肠道优势菌群均为厚壁菌门和变形菌门,但2组草鱼在其肠道菌群的结构和多样性等方面存在差异。大个体草鱼肠道中存在着更多比例的厚壁菌门以及具有纤维素降解能力的细菌,而小个体草鱼肠道中存在较多的潜在致病菌。[结论]草鱼肠道微生物可以作为内在因素影响草鱼的生长性能,这一结果也为进一步开发可促进草鱼生长性能的益生菌奠定了研究基础。     

草鱼肠道内分泌细胞中肽激素的免疫组织化学定位

通过过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)免疫组织化学染色方法,用10种哺乳动物激素培育出的抗血清对三尾草鱼肠道中免疫活性内分泌细胞进行了鉴别。与其中6种抗血清起反应的分别是:胃泌素、胰高血糖素样免疫反应物、抑胃肽、亮氨酸脑啡肽,P物质和牛胰多肽免疫活性内分泌细胞。其它4种抗血清在三尾草鱼肠道中没有发现免疫活性反应。草鱼肠道中各种免疫活性内分泌细胞的形态,大多数为开放型,少数为封闭型或兼有两种类型的特点。对6种免疫活性内分泌细胞的分布特点及其在肠道各段的密度进行了比较和讨论。     

浸泡免疫预防草鱼细菌性烂鳃病效果的研究

用酚灭活的柱状嗜纤维菌和从该菌体提取的菌体脂多糖浸泡接种２０～２５ｇ的草鱼鱼种，共浸泡２次间隔一周。通过检测受免鱼体血清、肠和体表粘液中凝集抗体效价、血液中吞噬细胞的吞噬活性和采用活菌攻毒的方法，探讨了浸泡免疫接种疫苗对预防草鱼细菌性烂鳃病的效果。结果表明，受免鱼体与对照鱼相比，血清、肠和体表粘液中凝集抗体效价和血液中吞噬细胞的吞噬活性都有明显上升。经活菌攻毒后，酚灭活柱状嗜纤维菌疫苗免疫组免疫保护率达３０％，而脂多糖疫苗免疫组免疫保护率为５５％。     

草鱼、鲤、鲢、鱅和尼罗非鲫淀粉酶的比较研究

草鱼、鲤、鲢、鳙的肝胰脏和肠淀粒酶的最适pH值分别为6.4和6.4,6.4和6.4,7.2和6.8,7.2和6.8。草鱼、鲤和尼罗非鲫的肝胰脏淀粉酶活性明显高于肠淀粉酶(P<0.025),而鲢和鳙的肝胰脏淀粉酶活性明显比肠的低(P<0.05)。尼罗非鲫胃淀粉酶活性明显比肝胰脏和肠的低(P<0.005)。5种鱼的肝胰脏淀粉酶活性由高到低的顺序为:草鱼、鲤>尼罗非鲫>鲢>鳙。草鱼和鲤肝胰脏淀粉酶活性分别是尼罗非鲫、鲢、鳙的2.6和7倍。肠淀粉酶活性由高到低的顺序为:尼罗非鲫>草鱼>鲤>鲢>鳙。尼罗非鲫肠淀粉酶活性分别为草鱼、鲤、鲢、鳙的1.11、1.72、1.93、2.41倍。草鱼和鲤肠淀粉酶活性由前肠向后肠逐渐升高,鲢、鳙和尼罗非鲫中肠淀粉酶活性略高于前肠和后肠。     

草鱼MyoD cDNA的克隆和序列分析

 用RACE技术从受精后约22 h的草鱼胚胎总RNA中扩增获得了草鱼MyoD基因的全序列,并对其序列进行了分析。结果表明，草鱼MyoD基因全长cDNA为1 597 bp,其中开放阅读框为825 bp，共编码275个氨基酸，结构分析表明该肽链第1～84个氨基酸为草鱼MyoD基因的Basic区,第98～142个氨基酸为草鱼MyoD基因的HLH结构域，该序列所编码的肽链没有信号肽；通过对比分析已知的GeneBank中其它脊椎动物MyoD基因发现，该基因编码的氨基酸肽链随动物由低等向高等进化有加长的趋势,且核苷酸以及推测的氨基酸同源性和动物之间的亲缘关系相一致；草鱼MyoD基因的克隆为研究家鱼的肌肉发育调控的机理以及肉质改良奠定了基础。     

温度对草鱼、鲤、鲢、鳙主要消化酶活性的影响

草鱼、鲤、鲢、鳙肝胰脏和肠蛋白酶最适温度分别为:45℃,45℃,55℃,55℃和45℃,45℃,50℃,50℃。临界失效温度分别为:56℃,54℃,62℃,61℃和54℃,57℃,61℃,60℃。淀粉酶最适温度分别为:30℃,30℃,35℃,35℃和30℃,30℃,35℃,35℃。临界失效温度分别为:53℃,46℃,52℃,49℃和50℃,47℃,50℃,52℃。脂肪酶最适温度分别为:30℃,30℃,25℃,25℃和30℃,30℃,30℃,30℃。临界失效温度分别为:45℃,38℃,38℃,38℃和45℃,38℃,38℃,38℃和42℃,40℃,40℃,40℃。草鱼、鲤肝胰脏的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶在最适温度条件下的活化能比肠的低,而鲢、鳙肝胰脏的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶最适温度条件下的活化能则比肠高。四种鱼最适温度下肝胰脏蛋白酶活化能的顺序为:鲤<草鱼<鲢<鳙;淀粉酶活化能的顺序为:草鱼<鲤<鲢<鳙;脂肪酶活化能的顺序为:鲤<草鱼<鲢<鳙。肠蛋白酶活化能的顺序为:鲤<鲢<鳙<草鱼;肠淀粉酶活化能的顺序为:草鱼<鲤<鲢<鳙;肠脂肪酶活化能的顺序为:鳙<鲢<草鱼<鲤。说明消化酶的活性与酶本身特性之一活化能高低有直接关系。     

不同减菌方式对冰温贮藏草鱼片品质的影响

分别采用紫外线照射、臭氧杀菌和柠檬酸淋洗3种方式处理草鱼片,然后在冰温(-0.7℃)下贮藏,考察了3种处理方式对草鱼片总菌数、挥发性盐基氮(TVB-N)、硫代巴比妥酸(TBA)值、pH值、总酸度和感官质量的影响。结果表明:与对照组相比,3种处理方式均能抑制细菌生长,延缓蛋白质腐败,其中以臭氧杀菌处理效果最好。由蛋白质腐败指标TVB-N值到达一级鲜度预测草鱼片货架期,臭氧杀菌、柠檬酸淋洗和紫外线照射处理后的货架期分别为15、10和9d。     

3种DNA提取方法对养殖池塘不同生境菌群PCR-DGGE分析的影响

比较3种DNA提取方法(溶菌酶法、CTAB法及珠磨法)对养殖池塘几种生境(底泥、饲料、草鱼肠道内容物及肠道壁)菌群PCR-DGGE分析的影响。结果表明,以3种提取方法获得的DNA为模板均能进行16S rDNA V3区特异性片段扩增；但不同DNA提取方法对池塘不同生境菌群DGGE指纹图谱存在显著影响。DGGE指纹图谱显示草鱼肠道内容物菌群(溶菌酶法)与肠道壁菌群(溶菌酶法)存在较高一致性,底泥菌群(CTAB法)及饲料菌群(溶菌酶法)与鱼体肠道菌群(包括内容物菌群和肠道壁菌群)则存在明显差异,但肠道菌群与底泥菌群的相似度相对更高。研究提示采用微生物分子生态学工具对养殖池塘不同生境进行菌群结构分析时,需提前优化DNA提取方法；在以投饲为主的养殖鱼塘中,草鱼肠道菌群更多源自于池塘底泥。     

草鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药物敏感性分析

从贵州兴义某水库网箱养殖的患病草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏中分离出菌落大小、形态一致的细菌,编号为GZ09007。经革兰氏染色、生理生化反应等表型鉴定为气单胞菌(Aeromonas)。通过扩增16S rRNA和gyrB基因序列并构建系统发育树,进一步鉴定该菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。该菌株具有act、aer、lip、exu、fla、ser等毒力相关基因,不具有alt、ast、gca T和ahy B等毒力相关基因。人工感染试验表明该菌对草鱼、鲫、团头鲂和鳙均具有强致病性,半数致死量LD_(50)分别为7.45×10~5、1.27×10~5、1.76×10~5和5.36×10~4 CFU·(g·B·W)~(-1)。药物敏感性试验表明该菌对萘啶酸、恩诺沙星和左旋氧氟沙星等12种药物敏感,对新霉素、呋喃唑酮中度敏感,对氨苄西林耐受。研究结果表明维氏气单胞菌GZ09007是引起此次草鱼发病的致病菌。     

猪源抗菌肽的粗提及生物学活性的初步验证

将新鲜猪小肠超声破碎,经高温处理、乙酸浸提后,高速离心提取上清,上清液再经Sephadex G-50凝胶层析纯化,收集洗脱液.用纸片法检测抗菌肽粗提物的抑菌活性;鸡胚接种试验检测抗菌肽粗提物抑制病毒的作用.结果表明,抗菌肽粗提物有明显的抑制菌、病毒增殖的活性.