Western blot检测家兔动脉组织蛋白质表达条件的优化

蛋白质免疫印记技术是研究和分析蛋白质的重要手段,由于其步骤繁杂、影响因素众多,常出现背景噪音高、非特异条带多、拖尾等问题,严重影响后续蛋白质定量分析。为建立最佳的检测家兔动脉组织中蛋白质表达的蛋白质免疫印记技术实验条件,以家兔动脉组织血管细胞粘附分子-1为目标蛋白,从电泳条件、抗体浓度、抗体孵育时间、温度及方法、免疫显色方法等方面进行了改良,成功建立了快速、灵敏、特异的蛋白质免疫印记技术体系;并比较了3种常用的酶免疫显色技术:3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)显色、增强化学发光法(enhanced chemil luminescence,ECL)X光片曝光及ECL化学发光冷却电感耦合成像系统(cooled charged-coupled device,CCD)成像的敏感性。结果表明ECL化学发光法比DAB显色法敏感性高出2～10倍,其中CCD系统敏感性高于X光片4倍,且操作简便,是最理想的检测方法。     

两种检测猪伪狂犬病gB抗体方法比较

为评价化学发光免疫分析法在临床检测猪伪狂犬病gB抗体中的适用性,将其与IDEXX公司ELISA抗体检测方法进行比对试验.对110份猪血清进行猪伪狂犬病gB抗体化学发光免疫分析法与ELISA法的检测.结果显示,以ELISA法为标准,化学发光免疫分析法检测猪伪狂犬病gB抗体的灵敏度、特异性、符合率分别为98.31%、100%、99.10%,Kappa=0.96,说明化学发光免疫分析法与ELISA法的符合率较高,且其操作步骤更简便,更省时,可以用于临床猪血清样品的猪伪狂犬病gB抗体的检测.     

鸡传染性支气管炎(IB)诊断方法的研究

本试验用鸡胚大量繁殖鸡传染性支气管炎病毒（IBV）,收集尿囊液,用1％胰蛋白酶处理制备IBV血凝抗原,建立了血凝—血凝抑制（HA—HI）检测IBV抗体的方法,其特异性强、操作简便。另外,本试验建立Dot—ELISA方法用于检测IBV,病料经处理后,点样于硝酸纤维素膜,加兔抗IBV抗体,经PPA—DAB—H_2O_2系统显色,其检测结果与双抗体夹心ELISA的检测结果一致。两种诊断方法的建立为临床上检测病原和监测抗体提供了便捷的手段。     

猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法的建立

实验通过纯化猪附红细胞体后免疫小鼠及家兔制备阳性血清,建立了猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法.实验结果表明,以鼠阳性血清1:200稀释后作为捕获抗体,4℃包被过夜,1%明胶溶液37℃封闭1 h,兔阳性血清1:400稀释后作为检测抗体,辣根过氧化物酶标羊抗兔Igc抗体h:8000稀释,37℃显色10min为最佳反应条件.同时进行特异性、敏感性、重复性实验.该方法对猪附红细胞体最低检出量为3.812μg·mL-1,具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望作为群体检测方法.     

着丝粒特异性蛋白CENP-Ⅰ的原核表达、纯化及抗体制备

用RT-PCR的方法从Hela细胞总RNA中获得编码CENP-Ⅰ蛋白第1-293位氨基酸的CENP-ⅠcDNA序列,采用基因体外重组法将其克隆到原核表达载体pET-32a（＋）内;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达、Ni^2＋-NTA亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白质;用纯化的蛋白质免疫家兔制备抗血清,琼脂糖免疫双扩法和Western blot鉴定得到高效价的特异性抗CENP-Ⅰ抗体.     

贵州鹅细小病毒感染诊断技术研究

利用鹅细小病毒贵州分离株制备琼脂扩散试验沉淀抗原,建立琼脂扩散试验方法;以该分离株免疫家兔、制备高免血清、提取IgG制备荧光抗体,建立荧光抗体检测技术;根据鹅细小病毒VP3基因设计一对引物,建立PCR检测技术;然后采用这3种技术对鹅细小病毒感染临床病例进行检测比较,结果表明,这3种诊断技术均具有较高的特异性,可用于鹅细小病毒感染的临床诊断,但以荧光抗体检测技术的敏感性最高。     

甘蔗宿根矮化病菌多克隆抗体制备及初步检测

以纯化培养的甘蔗宿根矮化病(RSD)病菌作为抗原,免疫健康家兔,制备了RSD多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附试验检测其效价,并通过斑点酶标免疫法(Dot blot enzyme immunoassays,DB-EIA)确定其工作浓度,同时与澳大利亚的抗体比较。结果表明,制备的RSD多克隆抗体效价大于1∶10000,在用DB-EIA法检测样本时的工作浓度以稀释10倍较好;与澳大利亚抗体的检测结果一致,但在印迹着色方面比澳大利亚的浅一些。试验结果表明,自制RSD抗体的效价略低于澳大利亚RSD抗体,但检测效果较好,可以满足今后在甘蔗生产上对RSD的检测要求。     

创伤弧菌快速检测法的建立

[目的]针对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,基于单克隆斑点杂交技术进行改良,建立一种创伤弧菌快速检测方法。[方法]由水产品牡蛎中分离获得一株创伤弧菌FD-1,以其灭活全菌为抗原免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。在此基础上,对传统斑点杂交技术进行优化改进,以化学发光试剂ECL替代传统TMB底物,进一步提高其灵敏度、缩短检测时间和简化操作步骤。[结果]与传统斑点杂交法相比,改良斑点杂交法的检测时间可缩短至2 h,检测限可达1×10~5CFU/m L。[结论]改良斑点杂交法比传统TMB底物斑点杂交法(1×10~7CFU/m L)灵敏度提高了100倍,操作过程简单,在水产品检验和医疗诊断方面具有良好的开发应用前景。     

恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质(PF3D7_0811600)的表达纯化及其多克隆抗体的制备

利用大肠杆菌原核表达并纯化恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600,免疫家兔制备特异性多克隆抗体,通过对虫体天然蛋白的识别,分析PF3D7_0811600在虫体内的表达。采用PCR技术从恶性疟原虫3D7株总DNA中获得PF3D7_0811600基因的目的片段,连接到p MD18-T克隆载体,得到的克隆质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建重组原核表达质粒p ET-PF3D7_0811600和p GEX-PF3D7_0811600,通过优化表达条件,分别在大肠杆菌中得到高效表达,并用亲和层析柱纯化目的蛋白质。用纯化的His标签重组蛋白质免疫家兔,用Western Blot方法检测制备的特异性多克隆抗体。结果表明:成功纯化并获得重组蛋白质,用间接ELISA方法检测多抗效价达到1∶16 000,用Western Blot检测结果表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性,能够识别虫体天然蛋白。恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600在虫体晚期表达,说明该蛋白在虫体发育的晚期发挥重要作用,猜测其可能与裂殖子入侵宿主红细胞有关。     

大黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖与诱导凋亡的研究

研究大黄素对宫颈癌Hela细胞的增殖与凋亡的影响。通过MTT法检测Hela细胞的存活率,Annexin V-FITC/PI双染法及流式细胞术检测Hela细胞凋亡,蛋白质免疫印记法检测p-JNK、JNK、Bcl-2、pro-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白的表达。大黄素对Hela细胞的增殖抑制效果呈浓度依赖性。Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术结果表明大黄素能够诱导Hela细胞凋亡。蛋白质免疫印记法表明,随着药物处理时间的增加,p-JNK、cleaved-caspase-3的蛋白质表达量逐渐增加,Bcl-2、procaspase-9的蛋白表达量逐渐减少。在实验条件下,大黄素可以抑制Hela细胞的增殖,诱导细胞凋亡。     

杨树MADS转录因子SVL基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备

为研究杨树MADS转录因子相关基因在逆境中的作用，以84K杨树叶片的cDNA为模板，通过PCR扩增得到了开放阅读框为684 bp、氨基酸个数为227的PtSVL基因；构建原核表达载体pET-B2M-PtSVL-3×FLAG，并在大肠杆菌B21（DH3）中大量表达。结果表明，获得的PtSVL-3×FLAG融合蛋白，大小为42.0 ku，主要以包涵体形式存在；用纯化后的蛋白免疫新西兰公兔制备PtSVL多克隆抗体；间接ELISA法和Western blot检测后多克隆抗体后显示其效价高，特异性好。获得的PtSVL多克隆抗体将为后续鉴定PtSVL蛋白的互作蛋白提供基础。     

原核表达c-myc蛋白的多克隆抗体制备

探讨利用小鼠制备抗人c—myc蛋白多克隆抗体的方法。利用含PET28a／c—myc质粒的EcoliBL21，对c—myc蛋白进行原核表达，并进行纯化。WesternBlot结果只出现一条62KDa大小的特异性目的蛋白条带。用原核表达的c—myc蛋白抗原免疫5只Balb／c小鼠，最终免疫后的第7d采血，并对其血清效价进行ELISA（Enzyme—linked immunosorbnent assay）测定，抗血清达1：640000。本实验结果为c—myc单克隆抗体制备和肿瘤诊断试剂盒的研发提供基础实验数据。     

Preparation and Identification of Specific Monoclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2

以人工合成 PCV2 Cap蛋白表位的串联多肽作为抗原免疫 BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了1株稳定分泌抗PCV2-rCap 蛋白的杂交瘤细胞株,命名为670#。该株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价为l∶100000。 Western blot结果显示,该株单抗可与表达原核 PCV2 PET32a-ORF2重组蛋白、真核表达 ORF1-ORF2串联蛋白及 PCV2全病毒细胞培养物反应;间接 ELISA证明该单核可与 ORF1-ORF2串联蛋白结合;IFA结果表明,该单抗可与天然PCV2病毒结合。该单抗的制备为 PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。     

鲫鱼一种新型SNRPC基因的蛋白表达和抗体制备分析

本研究构建了鲫鱼卵母细胞特异表达的新型SNRPC基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体特异性,为进一步研究新型SNRPC基因的功能奠定基础。首先设计引物,应用RT-PCR从鲫鱼成熟卵母细胞中获得含该基因片段,重组入原核表达载体PinPoint T中,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白并免疫家兔制备多克隆抗体,用Western blot方法检测此抗体特异性。成功构建了新型SNRPC基因重组表达载体,表达的蛋白经纯化后免疫家兔得到了特异的多克隆抗体。鲫鱼卵母细胞的新型SNRPC基因的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及抗体的制备为后续的研究提供了理论基础。     

干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白

旨在利用pLA载体将IBDV B87株VP2蛋白展示在干酪乳杆菌表面。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段,测序鉴定正确后,将目的片段构建在pLA穿梭质粒上,命名为pLA-VP2,然后将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中,构建IBDV重组干酪乳杆菌。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2,得到约90 kDa的融合蛋白,与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光,且重组菌荧光强度强于pLA菌对照组,应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率,约为80%。结果表明IBDV VP2蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面。     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FMDV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5120。[结论]该研究结果为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

毛细管电子捕获气相色谱法同时测定水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留

采用乙酸乙酯提取目标物，正己烷脱脂，微波辅助衍生化，建立了能同时测定水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留量的毛细管电子捕获气相色谱法（GC—ECD）。加标回收实验结果显示，氯霉素在1．0-200．0μg／L范围内、甲砜霉素和氟甲砜霉素在5．0～200．0μg/L范围内成良好的线性，相关系数均大于0．996；氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的检出限分别为0．1、0．2和0．2μg／kg，回收率在79．2％-88．0％之间，相对标准偏差在2．0％-4．1％之间。表明该方法定性定量准确、检出限低、重现性好、省时省力，可以满足水产品中3种氯霉素类药物的多残留安全检测。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

两种重组融合蛋白的分子生物学特性比较

使用DNASTAR软件,利用计算机模拟比较了带有亲和标记和连接肽的DAB389（Gly4Ser）2-αMSH与DAB389-αMSH两种融合蛋白的抗原性、亲水性、等电点及表位等分子生物学特性.结果显示,DAB389（Gly4Ser）2-αMSH的抗原性和表位明显低于DAB389-αMSH,而DAB389（Gly4Ser）2-αMSH的亲水性高于DAB389-αMSH,两者的等电点均为5.9.