柞蚕核型多角体病毒研究进展

柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus，简称ApNPV)，属杆状病毒科包含体杆状病毒亚科核型多角体病毒属，是柞蚕核型多角体病的病原。该成熟病毒包含体的断面分三层结构：最外层是致密层，次外层是多角体蛋白层，内部是病毒束。柞蚕核型多角体病毒的核酸为DNA，经限制性内切酶PstI，HindⅢ，BamH，XhoI，SalI，EcoR I和EcoR I BamH I酶解后，电泳分别形成31,25，6，15，24，5，7条谱带。柞蚕核型多角体病毒主要通过食下和体壁创伤途径感染柞蚕幼虫，不同病毒株对柞蚕的致病性存在着差异。柞蚕幼虫消化液对柞蚕核型多角体病毒有溶解、灭活作用；柞蚕幼虫中肠围食膜对柞蚕核型多角体病毒有灭活作用。柞蚕核型多角体病毒多角体在自然条件下有自然裂解现象，游离的病毒粒子在自然条件下很快失活。目前已建立柞蚕核型多角体病毒载体表达系统，并在分别在体内、体外表达了报告基因．     

柞蚕核多角体病毒基因工程载体的研究 Ⅰ柞蚕核多角体病毒DNA限制性内切酶图谱

本文研究了柞蚕核多角体病毒的分离、纯化、纯化后的病毒DNA经限制性内切酶Pat Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、XhoⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ及EcoRⅠ+BamHⅠ等酶解后电泳分别形成31、26、6、15、24、5及7条区带。据内切酶图谱测算柞蚕核多角体病毒的分子量为75.16±2.3×10~6道尔顿。并比较了柞蚕、蓖麻蚕及家蚕等核多角体病毒的亲缘关系。     

柞蚕核型多角体病毒ptp-2基因克隆及表达

    为研究柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)ptp-2基因特性,根据ApNPV PstⅠ-C片段核酸序列,设计引物克隆了ApNPV ptp-2基因;将ptp-2基因亚克隆至原核表达载体pQE-30,构建重组质粒pQE-ptp-2,并在大肠杆菌M15中进行诱导表达,表达量达菌体总蛋白的38.7%,经His标签杂交鉴定证明表达产物为His融合蛋白.以原核表达的His-PTP-2蛋白作为抗原,制作兔多克隆抗血清,Western blot分析表明:PTP-2蛋白不参与ApNPV包涵体的结构组成.     

基于宏基因组学的转基因棉田土壤微生物功能多样性分析

[目的]研究转基因棉田土壤微生物的功能多样性。[方法]采用直接法提取转基因棉根际土壤微生物总DNA,用限制性内切酶BamHI进行部分酶切,回收2.0～4.0 kb大小的片段插入到pUC19/BamHI脱磷载体上,转化到DH5α高效感受态细胞,构建宏基因组文库。随机挑取10个克隆序列测序,并通过NCBI预测可能存在的开放式阅读框和进行序列比对分析。[结果]该文库的外源插入片段平均长度为2.4 kb,90%以上克隆都含有插入片段,10个序列中存在着多种功能的开放式阅读框,包括一些水解酶、脱氢酶、脂解酶、修饰酶、抗生素及与电子传递链相关的酶类。[结论]该研究可为研究转基因棉大面积野外种植以后的生态安全性提供参考。     

柞蚕核型多角体病毒感染离体细胞的研究

柞蚕核型多角体病毒(Antheraea Pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus简称ApNPV)对樗蚕蛹精细胞和草地贪夜蛾Sf9细胞的感染是非同源昆虫细胞的感染。运用昆虫细胞培养、病毒感染及电子显微镜等病毒学技术研究了ApNPV在体外培养的樗蚕蛹精巢细胞中的感染情况,初步探明了ApNPV在体外培养昆虫细胞中的形态发生过程,表明它是典型的杆状病毒复制。并用该病毒以一定浓度感染草地贪夜蛾Sf9细胞,说明ApN-PV不能在Sf9细胞中复制。     

茶尺蠖核型多角体病毒湖北分离株的分子鉴定

运用PCR技术扩增茶尺蠖核型多角体病毒安徽分离株(EcobNPV-AH)和湖北分离株(EcobNPV-HB)的同源重复序列2(hr2),并对湖北分离株的hr2进行克隆和序列测定.结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒安徽分离株hr2扩增产物为2条DNA片段,大小约1300bp和1800bp,湖北分离株的hr2扩增产物为1条DNA片段,大小约1800bp,由基因型组成判断,EcobNPV-HB是新的地区分离株,其hr2全长1761个核苷酸,GC含量21.7%,编码540个氨基酸,具有重复性回文序列,较GenBank中登录的EcobNPV-AH的hr2多362个核苷酸.     

斜纹夜蛾核型多角体病毒多角体基因的克隆

在以５种限制性内切酶对ＳＩＮＰＶ基因组作酶解分析的基础上，以ＡｃＮＰＶ多角体基因的部分编码序列作探针，对其进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，发现ＸｂａⅠ酶切的２．９ｋｂ片段含有全部或部分ＳＩＮＰＶ多角体基因，并将该片段克隆至ｐｕｃ１８载体上。     

甘蓝夜蛾核型多角体病毒某些生化特性的测定

本文报道不连续系统的 SDS-PAGE 法对甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mamestrabrassicae nuclear polyhedrosis virus MbNPV)的多角体蛋白,病毒粒子结构多肽进行分析。结果表明,经热处理和温和碱解的多角体蛋白呈现一条带,分子量为28.2×10~3±500道尔顿。病毒粒子至少有15种多肽.MbNPV 多角体蛋白富含天门冬氨酸、谷氨酸。未检出色氨酸、限制性内切酶 ECoR Ⅰ,HindⅢ,BamH Ⅰ和 Pst Ⅰ分别把 MbNPV-DNA 酶解成15,13,7和10个限制性片段.由片段积加法计算得平均分子量为95.905±2.164Kbp.     

家蚕核多角体病素Lef-1和DA26基因的克隆及部分序列分析

 lef-1和DA26基因分别位于egt基因的上游和下游，从pUAc-egt中分离出EcoRI-XbaI 1.1kb的egt基因片段,进行缺口平移标记,获得探针。与BmNPV DNA经Hind Ⅲ酶切、电泳、转移至NC膜的DNA进行Southern blot杂交，发现BmNPV DNA的Hind Ⅲ D片段呈阳性。从BmNPV基因组中分离出10.4kb的Hind Ⅲ D片段,用EcoRI酶切得到Hind Ⅲ-EcoRI2.2kb、EcoRⅠ1.4kb和EcoRⅠ-Hind Ⅲ 6.8kb3个片段,分别克隆于pUC19中,命名为pUHE2.2、pUE1.4和pUEH6.8。经双链测序并与AcNPV相关基因序列进行比较，发现lef-1基因被克隆于pUHE2.2中,DA26基因克隆于pUEH6.8中。从所测定的lef-1和DA26基因的启动子及5’端部分序列来看，它们在AcNPV和BmNPV之间有极高的同源性。     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的克隆及表达

根据GenBank发表的序列(L33180)设计引物,利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段,将其连接至pMD18-T载体上,获得了该基因成熟蛋白阅读框序列.利用设计的酶切位点将目的基因从克隆载体上切下.表达质粒pGEX-4T-2经BamHI/XhoI双酶切,与目的片断连接,得到重组表达质粒pGEX/Bm75.将重组表达质粒pGEX/Bm75转化入大肠杆菌BL 21中,经IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE分析表明产生57 kDa左右的特异蛋白质条带.对表达产物进行Westernblotting分析,结果表明,pGEX/Bm75经IPTG诱导产生的57 kDa蛋白条带与抗体发生了很强的交叉反应,融合蛋白得到了表达.     

伪狂犬病病毒gG基因缺失通用转移载体的构建

对克隆有伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA SphI 15kb片段的质粒pBSA用SphI和KpnI消化，将含gG全基因及其上游PK基因，下游gD基因部分编码区的约2．6kb的片段亚克隆到消除了EcoRI位点的载体pUC19中，获得重组质粒pUSK(E)。以pEGFP-N1为模板，通过PCR扩增约0．3kb的SV40Poly(A)片段，并将其克隆到杆状病毒转座载体pFastBac1的NotI和PstI位点，利用pFastBac1的BamHI和PstI将含有9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区约9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区的400bp的缺失，构建了由gG启动子驱动gG部分编码区缺失的通用转移载体pgG-Uni。序列分析进一步证实：有7个单一酶切位点可供外源基因直接插入。上述结果为构建以伪狂犬病病毒作载体的多价基因工程疫苗以及利用标记蛋白探讨伪狂犬病病毒在体内的增殖与分布奠定了基础。     

弗兰克氏菌nifH及nifD基因的定位

利用限制性内切酶酶切和分子杂交等手段,对弗兰克氏菌菌株At4和Hr16的固氮基因克隆的nifH(pPC1201)、nifD(pPC1202)及nifK(pPC1203)基因为探针杂交,定位了At4和Hr16的nifH和nifD基因。同时发现,一条1.3kb的BamHI片段丢失。     

双孢蘑菇不同交配型同核不育单孢的基因组文库构建

对24个双孢蘑菇不育单孢进行两两杂交配对,以菌株9608为基准,获得了2种不同交配型的不育单孢菌株A+:9601、9608、9609、9612、AgQG841-1、AgLH830-4、AgLH830-6、AgQL8125-5;A-:9602、9603、9604、9607、Ag2k811-1、M7206-1、M7206-2、M7206-11、M7206-13。将这2种菌株进行DNA提取,并构建DNA文库,对文库进行酶切验证,用SalⅠ酶切,可切出20、14、9kb等3个片段,其中20、9kb为λ载体的左右臂,插入片段为14kb,与预期相符,说明文库的质量较高。     

牛Nramp1基因启动子的克隆及其活性分析

 【目的】牛Nramp1基因是主要的抗病候选基因,但其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究欲确定牛Nramp1基因的启动子区域,找到启动子核心序列和主要的调控区,探索Nramp1基因表达机制。【方法】采用基因克隆、DNA测序、半定量RT-PCR和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建牛Nramp1基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同节段的pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒,分别转染293T和RAW264.7细胞,并进行脂多糖(LPS)诱导,对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定。【结果】牛Nramp1基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,+58—-89区域具有基本的启动子功能,+58—-1 748启动子活性最强。进一步研究表明,-89—-205 bp区域、 -278—-1 495 bp区域存在着正调控元件,在-205—-278 bp区域内存在着负调控元件;另外,LPS能显著增强启动子活性,其诱导牛Nramp1基因的表达具有细胞特异性和剂量依赖性。【结论】成功构建了含推测的牛Nramp1基因启动子片段的重组报告基因载体, 确定了启动子核心区域和主要的调控区域。     

马立克氏病病毒（MDV）B抗原基因的克隆及鉴定

将ＭＤＶＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中含Ｉ３片段的质粒ｐＡＣＹＣ１８４和Ｋ３片段的质粒ｐＨＣ７９扩增，用碱裂解法抽提质粒后，利用相应的限制性内切酶切出目的基因片段，连接到合适的载体上，构建了完整的ＭＤＶＢ抗原基因克隆载体。通过内切酶分析，地高辛（ＤＩＧ）－探针原位杂交，ＤＮＡ序列预测，确认克隆的Ｂ抗原基因正确。     

斜纹夜蛾多角体病毒基因组的限制酶解分析

用3种限制性内切酶分析了斜纹夜蛾多角体病毒（SLNPV）基因组，结果显示：SLNPV基因组DNA含量在134．6～144．0kb左右，SLNPV的XbaI酶切片段为26个，XbaI和EcoRI双酶切片段为36个，EcoRI酶切片段为24个。还对SLNPV含丰富的EcoRI和XbaI酶切位点的原因进行了讨论。     

玉米特异表达启动子驱动下结核esat-6抗原基因植物表达载体的构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Esat-6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,将globulin-1-Esat6联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中,构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GEsat-6,电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.通过对pC1300GEsat-6质粒酶切鉴定和测序分析表明克隆的Esat-6与预期相符,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.     

笋瓜韧皮部特异性启动子的克隆分析及新型植物表达载体构建

根据已报道具韧皮部组织特异性的笋瓜韧皮部蛋白2（PP2）基因序列设计引物，以山西本地种笋瓜叶片基因组DNA为模板，用PCR法扩增得到了长度为966bp的PP2基因启动子片段，克隆入pUCm—T载体后，经鉴定获得了新的重组质粒pUCm—PSP，测序和序列分析表明与两个已报道的片段分别有95％和99％的同源性，推测具有相似的启动子功能。分别用限制性内切酶PstⅠ和BglfⅡ双酶切重组质粒pUCm—PSP和由CaMV35S组成型启动子驱动GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1302，分别回收pUCm—PSP重组质粒中的PSP小片段和pCAMBIA1302植物表达载体中去掉GFP报告基因上游CaMV35S组成型启动子的大片段，经连接、转化和鉴定后，构建了由PSP驱动报告基因GFP的新型植物表达载体pHZ03。利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中，为进一步研究其表达功能奠定了基础。     

家蚕丝蛋白基因分子标记的建立

利用已知丝素基因和丝胶基因的克隆片段（ｐＦｂ１００，ｐＳｒ１００）为探针和１２ 个限制内切酶，对家蚕基因组ＤＮＡ进行了限制性片段长度多态性分析，结果表明，其ＤＮＡ多态性可用作家蚕基因图谱的分子标记。