应用双抗体夹心酶联免疫方法检测仿刺参病原菌——黄海希瓦氏菌AP629

“化皮病”是当前仿刺参养殖的最严重的疾病，导致大量死亡，严重影响我国水产养殖的经济效益。以仿刺参病原菌--黄海希瓦氏菌(Shewanella smarflavi)AP629兔源多克隆抗体和鼠源单克隆抗体3D9分别作为包被抗体和检测抗体，建立了黄海希瓦氏菌AP629的双抗体夹心ELISA快速检测方法。多克隆抗体和单抗3D9的最佳稀释倍数分别为1∶400和1∶80，该方法特异性强，与弧菌、气单胞菌、爱德华氏菌、大肠杆菌等均无交叉反应，检测灵敏度高。以PBS和仿刺参体壁匀浆上清液为悬菌介质的最低检出限分别为104 cells/mL和106 cells/mL。对人工感染黄海希瓦氏菌的10头仿刺参进行检测，其检测结果均为阳性，稳定性和重复性良好。该方法的建立有助于快速准确地诊断由黄海希瓦氏菌AP629引起的仿刺参疾病。     

仿刺参补体类似物活性的测定

用3种方法对仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液及体腔细胞中的总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4活性进行测定.结果表明:在仿刺参体腔液、体腔液上清液和体腔细胞中能够检测到总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4,表明仿刺参体内存在有脊椎动物的补体类似物,且活性与正常人补体活性相似.仿刺参体内总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4的活性依次顺序均为体腔液＞体腔细胞＞体腔液上清液.     

几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响

测定了仿刺参Apostichopus japonicus 体腔液补体溶血活性,并研究了几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响.结果表明:仿刺参体腔液补体溶血活性为(68.8±13.5) U/mL;仿刺参体腔液在pH为7.5、Mg2+浓度为8 mmol/L的EGTA-Mg-GVB缓冲液和20 ℃条件下恒温水浴90 min时,其溶血活性最高;Mg2+对仿刺参体腔液补体的溶血活性有影响,苯甲基磺酰氟(PMSF)、酵母聚糖、甲胺和肼对仿刺参补体旁路溶血活性均有明显的抑制作用.     

仿刺参体壁的组织学和组织化学

用组织学和组织化学方法对仿刺参Apostichopus japonicus体壁的结构和成分进行了研究。组织学研究结果表明:仿刺参体壁自外向内由上皮层、结缔组织层、肌肉层和体腔上皮层组成。上皮层主要包括一层薄的角质层和2~3层上皮细胞,结缔组织层内含丰富的胶原纤维,肌肉层主要是平滑肌,体腔上皮层由单层扁平上皮组成。组织化学研究结果表明:仿刺参体壁各层(除体腔上皮层外)均富含糖类和蛋白质,不含脂类;碱性磷酸酶和酸性磷酸酶在体壁中存在酶活性的部位相同,主要在结缔组织层的空洞状结构处以及结缔组织层与肌肉层交联处。     

低盐胁迫下仿刺参DD104基因的定量表达分析

以2龄仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,利用实时定量PCR技术分析了DD104基因在仿刺参不同组织中以及低盐胁迫后不同时间的表达情况.结果表明:DD104基因在仿刺参管足中的表达水平最高,在体腔液、触手、呼吸树中的表达水平次之,在体壁、肌肉和肠中的表达水平较低;仿刺参在受到低盐胁迫后,体内DD104 mRNA的表达随盐度胁迫时间的增加呈现波动性增减,胁迫72 h时DD104基因的表达最强,在肌肉和管足中的表达量达到最大;胁迫48 h时肠组织中的表达量最大;胁迫24 h时体腔液中的表达量最大.研究表明,低盐胁迫后DD104基因在仿刺参不同组织中的表达发生变化的时间点不同,低盐胁迫下DD104基因表达量的变化规律说明该基因的表达可能与渗透胁迫密切相关.     

大黄和公丁香对致病性哈氏弧菌及其生物膜的体外抑制作用

[目的]观察大黄（Rheum officinale）和公丁香（Flos caryophylli对哈氏弧菌（Vibrio harveyi）及其生物膜（Biofilm）的体外抑制作用.[方法]采用琼脂扩散法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌的体外抑菌作用;采用倍比稀释法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）;采用MTT法评价2种中草药液对哈氏弧菌生物膜形成的影响.[结果]大黄对哈氏弧菌的抑菌圈直径为（15.31±0.4）mm,MIC和MBC均为7.813 mg/m1;公丁香对哈氏弧菌的抑菌圈直径为（11.53±0.6）mm,MIC和MBC分别为15.625和62.5 mg/ml;2种中草药液浓度分别在7.81和0.97 mg/ml以上时对生物膜的形成有极显著抑制作用（P＜0.01）.[结论]大黄和公丁香对哈氏弧菌及其生物膜均有明显抑制作用,其中大黄的作用比公丁香更强.     

仿刺参体腔液中酚氧化酶活性的分析

在(22±1)℃下抽取体质量为95.0～ 105.0 g的仿刺参Apostichopus japonicas体腔液,制备体腔液及体腔细胞溶解上清液(CLS),分别测定其酚氧化酶(PO)活性,检测分析不同刺激物(CaCl2、MgCl2、LPS、SDS、Trypsin和甲醇)对酚氧化酶原(proPO)系统的激活效果,并比较了不同规格仿刺参体腔液的酚氧化酶活性.结果表明:仿刺参体腔液中的PO活性个体差异较大,平均为(146.90±55.60)U,体腔液与不同激活剂作用后PO活性均无明显变化;CLS中的PO活性为31.82 U,其在100 mmol/L MgCl2作用后PO活性大幅度提高,proPO比活为43.9U,CLS与LPS、CaCl2和甲醇作用后PO活性无明显增加,与SDS和Trypsin作用后PO活性表现出一定的抑制.研究表明,仿刺参体腔液中的PO主要存在于体腔液中,CLS中的PO活性较低,proPO主要存在于体腔细胞中,可被Mg2+大幅度激活.52.4～68.5、20.7 ～24.4、4.9～5.6 g3种规格的仿刺参体腔液中的PO活性分别为(42.18±7.62)、(34.10±9.28)、(33.29±7.42)U,表明不同规格仿刺参体腔液中的PO活性存在一定差异,总体呈现随规格的增大PO活性增强的趋势,其中100 g左右的仿刺参与3个较小规格的仿刺参体腔液中的PO活性存在显著性差异(P＜0.05).     

复方中草药对仿刺参免疫力和抗病力的影响

将以黄芪、党参为主药并加入另外5味中草药所配伍的复方中草药粉碎制剂,以质量分数分别为0%（对照组）、0.5%、1.5%和2.5%的剂量添加于基础饲料中,连续投喂仿刺参Apostichopus japonicus37d,在试验开始后第1、2、3、4周采样,测定仿刺参的肠、触手、体壁、肌肉和体腔液中的抗菌活力及体腔细胞的吞噬活性;于试验开始后第4周,用仿刺参＂化皮病＂病原菌黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi以3.7×108个/mL的浓度在每头仿刺参背部注射0.1 mL的菌悬液,每天观察记录死亡个体症状,统计死亡率,计算相对保护率（共观察记录7 d）。结果显示：各组的抗菌活力均随着用药时间的延长、用药浓度的加大而升高,总体趋势表现为2.5%添加组〉1.5%添加组〉0.5%添加组〉对照组;各用药组仿刺参的体腔细胞吞噬能力均随着用药时间的延长呈现先升高后降低的趋势,第2、3周达峰值,总体趋势表现为1.5%添加组〉2.5%添加组〉0.5%添加组〉对照组;攻毒试验结果显示,对照组仿刺参3 d后全部死亡,第7天各用药组相对保护率依次为1.5%添加组〉0.5%添加组〉2.5%添加组,分别为30.0%、20.0%和10.0%。由此表明,该复方中草药可以显著提高仿刺参的免疫力和抗病力,以1.5%添加剂量组的效果最佳。     

两种致病菌对杂交东方鲀非特异性免疫和抗氧化指标影响

为研究迟钝爱德华氏菌和哈氏弧菌感染对杂交东方鲀"冀研一号"(菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂)非特异性免疫和抗氧化指标影响,分别对杂交东方鲀腹腔注射PBS、迟钝爱德华氏菌和哈氏弧菌,注射后6、12、18、24和36h分别取肝胰脏,测定其谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活力。结果表明,在攻毒后36 h内,注射迟钝爱德华氏菌"冀研一号"东方鲀肝胰脏总超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活均极显著升高(P0.01);攻毒后36 h内谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽均表现升高趋势。感染哈氏弧菌后,肝胰脏中谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧化物歧化酶活力均高于对照组;谷胱甘肽含量表现升高趋势。试验鱼体感染致病菌后,引起肝胰脏非特异性免疫和抗氧化指标变化。     

刺参4个功能基因的表达分析

为研究刺参Apostichopus japonicus的生长发育,采用实时定量PCR方法,对刺参腱生蛋白基因、胶原蛋白α2基因、整合蛋白αV基因和整合蛋白βL基因等4个候选功能基因不同月龄的组织表达进行了分析。结果表明:刺参12、13、14月龄时,腱生蛋白基因在刺参肠、管足、呼吸树、皮肤、体壁、体腔液细胞、疣足和纵肌等8个组织中均有不同程度的表达,其中在体腔液细胞和呼吸树组织中的表达量较高(P0.05);胶原蛋白α2基因在刺参管足、呼吸树、体壁、疣足和纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加,其中在呼吸树组织中表达量最高,在纵肌、疣足、体壁、肠和体腔液细胞等组织中的表达量逐渐降低;整合蛋白αV基因在纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加;整合蛋白βL基因在皮肤、体壁、疣足和管足组织中的表达量较低。本研究结果为深入研究刺参这4个功能基因提供了参考。     

仿刺参体腔细胞原代培养方法初探

以仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞为材料，分别用体腔液和MEM、L-15两种培养基进行原代培养，初步探讨了仿刺参体腔细胞培养的基本条件。结果表明：在18℃下封闭培养，体腔细胞在体腔液中直接培养能够贴壁、伸展，细胞呈球形和上皮样，但凝集现象严重；在合成培养基（MEM、L-15）中，体腔细胞凝集明显减少；与MEM培养基相比，体腔细胞在L-15培养基中贴壁时间长，伸展状态好，上皮样细胞较多，可培养至72h；培养基中血清的添加量与细胞的培养状态和可培养时间关系不明显。     

仿刺参体腔细胞单克隆抗体的制备及特性分析

应用杂交瘤技术制备了4株稳定分泌抗仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其单克隆抗体的特性进行了分析。结果表明：单抗1C7和1H7主要结合淋巴样细胞,单抗2E8可与所有体腔细胞结合,单抗4E9主要结合球形细胞;单抗2E8、4E9与仿刺参体腔液具有明显的交叉反应,单抗1C7和1H7则与体腔液无交叉反应;单抗1C7和4E9属于IgG1,2E8属于IgG2a,1H7属于IgM亚型;单抗1C7和1H7均可识别相对分子质量为37 000的蛋白,单抗2E8可同时识别相对分子质量为37 000和61 000两种蛋白,单抗4E9可识别相对分子质量为108 000的蛋白。该单抗的制备为进一步研究仿刺参体腔细胞和体腔液之间的关系,体腔细胞的分类、分布、发生、分化及功能提供了新的工具。     

益生菌对生物絮团养殖系统中刺参幼参生长、消化酶和免疫反应的影响

为了解益生菌对生物絮团养殖系统中刺参Apostichopus japonicus幼参生长、消化酶和免疫反应的影响,选择体质量为(10.77±0.07)g的健康幼参,随机分配到6个盛有20 L沙滤海水的聚乙烯养殖箱中,每箱放30头幼参,试验设对照组和益生菌组(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis+硝化菌),每组设3个平行,对照组每天投喂1次基础饵料(约为幼参体质量的4%)并添加蔗糖(基础饵料的70%),益生菌组在对照组基础上,每3 d向水体中添加枯草芽孢杆菌和硝化菌制剂各1.8 g,养殖试验共进行60 d。结果表明:与对照组相比,养殖30、60 d时,益生菌组幼参的特定生长率均显著提高(P0.05);益生菌组幼参肠道淀粉酶和脂肪酶活力均显著增强(P0.05),但胰蛋白酶活力与对照组无显著性差异(P0.05);益生菌组幼参的体腔细胞吞噬活力、体腔液和体腔细胞裂解液溶菌酶活力均显著增强(P0.05)。研究表明,生物絮团养殖系统中添加益生菌可促进幼参生长,提高消化酶活力和增强免疫反应。     

饲料中不同类型的硒对仿刺参幼参生长和免疫指标的影响

在水温为13.0~20.0℃、盐度为31.0~32.0和pH为7.5的条件下,将初始体质量为5.36~5.57 g的仿刺参Apostichopus japonicus幼参放养在塑料水槽中（40 L）,每箱15头,分别投喂在基础饲料中添加0.4 mg/kg硒粉、富硒酵母、蛋氨酸硒和亚硒酸钠的试验饲料,以未添加硒的基础饲料作为对照组,每个试验组设3个重复。60 d的饲养结果表明：摄食添加硒饲料的仿刺参的增重率、体壁的粗蛋白含量和对饲料中粗蛋白的表观消化率均显著高于对照组（P〈0.05）,其中摄食添加蛋氨酸硒一组的仿刺参增重最大,摄食添加富硒酵母的次之;摄食添加硒饲料的仿刺参体腔液中超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性均高于对照组,但差异不显著（P〉0.05）,而摄食添加酵母硒组的仿刺参体腔液中酸性磷酸酶（ACP）的活性显著高于对照组（P〈0.05）。饲料硒能促进仿刺参的生长,可能与提高饲料蛋白质的消化率有关;饲料硒能提高仿刺参的成活,可能与提高体腔中SOD、CAT和ACP的活性有关。试验表明,饲料中的有机硒能促进仿刺参对饲料蛋白质的消化和积累,进而促进其生长的效果优于无机硒。     

饲料中β-胡萝卜素和虾青素添加量对仿刺参幼参生长及抗氧化能力的影响

在水温11．0～20．0℃、盐度35、pH7．5的实验室条件下,将初始平均体质量为3．89g的仿刺参Apostichopusjaponicus幼参放养在60L的塑料水槽中,投喂添加30、60、90mg／kg β-胡萝卜素和虾青素的饲料,分别记为A、B、C、D、E、F组,以不添加此物质的基础饲料作为对照（G组）,每组设3个重复,饲养80d后测定幼参的生长和几种抗氧化酶的活性。结果表明：摄食添加β-胡萝卜素的饲料时,仿刺参的特定生长率随添加量的增加而升高,A、B、C组分别比对照组提高6．67％、73．33％和100．0％,但仅C组与对照组差异显著（P〈0．05）;摄食添加60mg／kg和90mg／kg虾青素的饲料时,仿刺参的特定生长率比对照组提高113．33％和66．67％,但仅E组与对照组差异显著（P〈0．05）;试验组仿刺参体腔液中的总抗氧化能力（T-AOC）随饲料中β-胡萝卜素和虾青素含量的增加而升高,除A、B组外其余各试验组均显著高于对照组（P〈0．05）,饲料中添加虾青素的各组仿刺参体腔液的平均总抗氧化能力（12．77U／mL）比添加β-胡萝卜素的各组平均值（8．77U／mL）高45．61％,表明虾青素的抗氧化能力高于β-胡萝卜素;C、E、F组仿刺参体腔液中的SOD和CAT活性均显著低于对照组（P〈0．05）,而A、B、D组与对照组差异不显著（P〉0．05）;试验组仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶活力及体壁成分较对照组均无显著差异（P〉0．05）。     

不同规格刺参的非特异性免疫活性研究

同一养殖池塘不同规格刺参的非特异性免疫活性为：小规格刺参的体腔细胞数和体腔液的溶细胞活性显著大于大规格刺参（P〈0．05）;随着刺参的生长,小规格刺参的溶菌酶活性逐渐增加,但与中、大规格的刺参没有显著性差异;其他免疫指标包括吞噬杀伤、COP、ACP及NOS活性等都与体重呈正相关,但差异不显著．结果表明,不同规格刺参的非特异性免疫活性虽有差别,但并不影响其生长．     

饲料中添加蛋氨酸硒对仿刺参幼参存活、生长及免疫指标的影响

在水温为14.0～8.0℃、盐度为31～32和pH为7.5的条件下,将初始体质量为1.30～1.68 g的仿刺参Apostichopus japonicus幼参饲养在塑料水槽（40 L）中,投喂蛋氨酸硒添加量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg的饲料60 d,每种饲料设3个重复,每个重复组放15头仿刺参。试验结束后饥饿24h,测定仿刺参体质量的特定生长率（SGR）,体腔液中过氧化氢酶（SOD）、超氧化物歧化酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）的活力,体壁干物质和肠干物质中硒的含量。结果表明：各组仿刺参的成活率为100%;当蛋氨酸硒添加量为0.6 mg/kg时,仿刺参幼参的SGR最大,且显著高于对照组（P〈0.05）,当硒添加量为1.0 mg/kg时,仿刺参幼参的SGR值最小;当硒添加量为0.6 mg/kg时,仿刺参对饲料干物质和粗蛋白的表观消化率最高,且显著高于对照组（P〈0.05）;各试验组仿刺参体壁干物质中蛋白质含量均显著高于对照组（P〈0.05）,且当硒添加量为0.4 mg/kg时,蛋白质含量最高;当硒添加量为0.6 mg/kg时,幼参肠中的硒含量最高,且显著高于对照组（P〈0.05）,但当硒添加量为0.4 mg/kg时,幼参体壁中的硒含量最高,其次为0.6 mg/kg硒组;除硒添加量为1.0 mg/kg外,各试验组仿刺参体腔液中的SOD、CAT值均显著高于对照组（P〈0.05）,添加量分别为0.8 mg/kg和0.4 mg/kg时达到最高,其次是0.6 mg/kg组;各试验组仿刺参ACP的活性均显著高于对照组（P〈0.05）,硒添加量为0.4 mg/kg时达到最高。研究表明,仿刺参幼参饲料中蛋氨酸硒的适宜添加量为0.4～0.6 mg/kg。     

Sea urchin response to foreign substances

An assessment of the response of Strongylocentrotus purpuratus to substances injected into the coelom shows that (i) foreign molecules are cleared from the coelomic fluid more rapidly than native molecules, (ii) coelomocytes can respond selectively to albumins of human and bovine origin, and (iii) immunization attempts fail to elicit accelerated coelomocyte uptake or accelerated clear-with antigen.