洋桔梗Double Mariachi Rink高效遗传转化体系的建立

以洋桔梗品种Double Mariachi Pink为供试材料,探讨影响根癌农杆菌介导法遗传转化的一些因素,包括Cb(羧苄青霉素)脱菌浓度、Km(卡那霉素)筛选浓度、农杆菌的侵染浓度和预培养时间等.研究结果表明:脱菌培养基中Cb的浓度为200mg/L时,抑制农杆菌生长但不显著影响叶片不定芽分化;不定芽分化阶段和生根阶段的适宜Km筛选浓度分别为30mg/L和15mg/L;外植体预培养3d,在D600nm≈0.5的农杆菌菌液中侵染10 min后,Km筛选得到的抗性植株GUS染色蓝斑率最高,达到86.7%.     

农杆菌介导菜豆几丁质酶基因转化洋桔梗

通过农杆菌介导法将抗真菌的几丁质酶基因转入洋桔梗,以提高其对真菌病害的抗性。结果表明,成功克隆了抗真菌活性较强的菜豆几丁质酶基因,构建了植物表达载体,并对洋桔梗Double Mariachi Pink叶块进行转化,获得了卡那霉素抗性植株,对抗性植株进行了2次PCR检测(nptⅡ基因),第1次PCR检测获得了13个阳性株系,培养60 d后再进行第2次PCR检测,获得11个阳性株系,再对生长良好的5个转基因株系进行RT-PCR检测,获得了3个阳性株系。3个阳性株系的几丁质酶平均活性(0.215 U、0.225 U和0.286 U)均显著高于未转化植株(0.133 U),转基因株系几丁质酶粗提液对大豆链霉菌5A、5E和灰葡萄孢菌3种指示真菌的抑菌圈直径均显著大于未转化植株,其中抑菌效果最好的株系对上述3种指示真菌的抑菌圈直径与对照相比,分别增大了106.00%、90.91%和71.53%。     

洋桔梗基因工程研究进展

对近10年来国内外洋桔梗遗传工程方面的研究进展进行了综述,提出了洋桔梗转基因过程中存在的问题,并就其应用前景进行了展望。     

农杆菌介导洋桔梗遗传转化影响因素的研究

以洋桔梗品种Double Mariachi Pink叶片为外植体,研究了影响农杆菌介导遗传转化效率的几个重要因素。结果表明,叶片外植体与农杆菌合适的共培养时间为5 d;以新的切割方法——刺孔法切割叶片,每个叶块外植体再生不定芽平均15.22个,明显多于三刀切的11个;刺孔法的叶块转化率达到77.7%,每个叶块再生卡那霉素抗性苗平均0.64株,明显高于三刀切的57.7%和0.38株;在刺孔法处理中,与孔外边缘切口相比,分布均匀的孔内切口利于更多不定芽的再生和卡那霉素抗性苗的形成。     

由ACC合成酶反义基因转化所得枣树其RNA表达量的测定

利用real—time RT—PCR对转基因枣树中的anti—ACSG的RNA表达量进行了定量测定．样品扩增产物荧光量随着扩增循环数的增加而呈现“S”形增加；经熔解曲线分析，其扩增产物中未捡出非特异性产物和引物二聚体；扩增产物的Cr值和模板cDNA起始浓度两者之间呈线性相关(R^2＝0．9929)；转化体中anti—ACSG RNA表达量约为4500—10300拷贝／g组织。     

根癌农杆菌介导反义ACC合成酶基因对枣树的转化

以枣树鲜食品种鸡蛋枣为材料,通过根癌农杆菌介导ACC合成酶反义基因转化．得到了转基因植株．预培养1d的枣树幼嫩茎段经根癌农杆菌感染后共培养3d．转移至分化选择培养基MS(1／2NO3) 0．15mg／L NAA 1．75mg／L．ZT 10mg／L Km 500mg／L Carb上诱导产生不定芽,将抗Km不定芽先后在15mg／L Km的生长、增殖和生根培养基上继续选择．诱导成完整植株．经PCR检测从抗Km植株中选择到7株阳性植株．进一步经Southern杂交证实有6株外源基因已整合到了枣树基因组中．Real—time PCR定量检测表明,ACC合成酶反义基因在5株转基因植株中得到表达．     

矮牵牛遗传转化查尔酮合酶基因的研究

本文建立了矮牵牛的遗传转化体系,并将查尔酮合酶基因转入矮牵牛。经PCR检测,得到34个转查尔酮合酶基因株系。探讨了查尔酮合酶基因对花色及育性的影响。     

洋桔梗组培技术研究

[目的]探讨外源激素水平等对洋桔梗愈伤诱导、不定芽分化、继代增殖、生根的影响,以建立其组织培养工厂化育苗生产体系。[方法]通过无菌插种获得无菌苗,取其带腋芽茎段为外植体,采用随机区组试验筛选愈伤形成、不定芽分化、增殖与不定根形成的适宜激素水平。[结果]适宜洋桔梗愈伤与不定芽分化的培养基为MS＋6-BA 0.1～0.5 mg/L＋NAA 0.1～0.5 mg/L;继代增殖适宜培养基为MS＋6-BA 0.1～0.5 mg/L＋NAA 0.1～0.5 mg/L＋GA 0.1～0.5 mg/L＋干酪素50～100 mg/L;生根适宜的培养基为1/2MS＋NAA 0.1～0.3 mg/L或IBA 0.5 mg/L或IAA 0.5 mg/L,25 d内生根率可达95%以上;在蛭石∶珍珠岩∶腐叶土=4∶4∶2基质中驯苗,成活率可达96%以上。[结论]利用组织培养技术对洋桔梗进行快速繁殖,实现其工厂化育苗具有重要的现实意义。     

农杆菌介导的百合ACO反义基因遗传转化的研究

以东方百合‘索邦’(Liliumoriental‘Sorbonne’)无菌苗鳞茎、鳞片叶及愈伤组织为外植体,通过EHA105和GV3101两种根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株介导,将ACO反义基因导入东方百合"索邦"。结果表明,愈伤组织预培养7 d,侵染30 min,EHA105菌液浓度OD=0.8,共培养5 d,可获得7.14%的转化率。经GUS、PCR、PCR-Southern及基于梯状胶回收的PCR法检测证明ACO反义基因已转入转化植株基因组中。     

农杆菌介导的猕猴桃ACO反义基因遗传转化

以猕猴桃米良1号的当年生嫩枝及叶片为外植体,构建了双右边界双元载体pCAMBIA1300-actin-term-2,通过根癌农杆菌EHA105菌株介导,将ACO反义基因导入猕猴桃植株基因组.结果表明,愈伤组织预培养20d,农杆菌侵染30 min,EHA105菌液浓度D=0.6,共培养5d,经PCR法检测证明ACO反义基因已转入转化植株基因组中.     

洋桔梗害虫蠼螋的发生与危害研究

调查了洋桔梗害虫蠼螋在玉溪市红塔区和通海县的发生和危害情况。结果表明,蠼螋以成虫、若虫咬食植株近地面茎部、根部表皮及皮层,造成植株萎蔫、死亡。蠼螋的发生年度间大致相同,一般田间3月底至4月初开始出现,7~8月数量最大,9~10月数量逐渐减少。蠼螋在玉溪市洋桔梗主要栽培地均有发生危害,不同地点发生程度不同。     

桃果实中ACC合酶基因克隆及基因沉默载体构建

植物中乙烯是一种具有促进果实成熟和衰老的内源激素.ACC合酶是植物乙烯生物合成途径中一个重要的限速酶,沉默ACC合酶基因的表达能减少植物性内源性乙烯的产生.以中华寿桃为研究材料.采用RT-PCR技术,克隆获得ACC合酶基因.将该基因酶切回收后连接到pTRV-RNA2载体上,转化DH5a,筛选阳性克隆,进行酶切鉴定.测序后与已知序列进行同源性比较,其同源性达到99%,表明将ACC合酶基因成功连接到pTRV-RNA2基因沉默载体上.     

洋桔梗701品种组培快繁技术研究

以洋桔梗701品种腋芽为试验材料,MS为基本培养基,探讨不同植物生长调节剂对洋桔梗外植体诱导培养以及增殖和生根培养的影响。通过比较KT与BA两组实验对洋桔梗的增殖效果,得出增殖效果最好的配方为：MS＋6-BA0.2毫克/升＋NAA0.1毫克/升,增殖率可达到345%,植株长势好粗壮,叶片浓绿。但较高6-BA浓度,会使洋桔梗组培苗叶片出现玻璃化现象。通过比较NAA与NAA＋BA两组实验对洋桔梗的生根效果,得出生根效果最好的配方是MS＋NAA0.8毫克/升,其根数多,较健壮。     

转淀粉分支酶反义基因（sbe2b）玉米直链淀粉含量的变异分析

以利用花粉管通道法转化玉米淀粉分支酶基因的反义表达载体的后代中的PCR阳性植株为试材,分析其直链淀粉含量的变异.结果表明:转基因玉米的淀粉分支酶活性有明显的下降,种子的直链淀粉含量比未转化对照有显著提高,T1代种子的直链淀粉含量提高幅度为2.2%～24.9%,最高含量达到了59.4%,表明外源基因的导入有效地抑制了淀粉分支酶基因的表达.转化的淀粉分支酶反义基因能稳定传递,T2代大部分株系的分离比率大致呈3:1,符合孟德尔分离规律;部分株系的分离比率接近于15:1,但卡平方测验不显著.     

自然光及NH4+对洋桔梗玻璃化的影响

以洋桔梗的叶片、不定芽、茎段等外植体为试验材料研究自然光及NH4 对洋桔梗玻璃化的影响.结果表明,同一培养基配方洋桔梗正常不定芽诱导率在自然光下比培养室内提高30%左右;NH4 除去或减半对洋桔梗玻璃化防治无明显效果,反而使同一条件下洋桔梗叶片诱导总不定芽数及正常芽数有所降低;自然光对已经玻璃化的不定芽转化无明显效果.     

ACC解氨酶基因转入青花菜的研究

利用根癌农杆菌介导，以下胚轴为外植体把ACC解氨酶基因转入青花菜栽培品种“上海2号”，获得了转基因再生植株，对转化植株进行GUS检测，初步证明ACC解氨酶基因已转入青花菜中表达，另外，对影响转化频率几个因素，即：农杆菌的悬浮液、共培养的方法、维持培养的时间进行了探讨，由此总结出了青花菜转基因的优化程序，采用优化程序的转化率达到了5.5％。     

萘乙酸对洋桔梗种子发芽的影响

[目的]研究萘乙酸（NAA）对洋桔梗种子萌发的影响。[方法]比较不同浓度的NAA对洋桔梗种子的发芽势、发芽率、发芽指数等指标的影响。[结果]在0.001～1.000 mg/L浓度范围内,不同浓度的NAA处理能明显提高洋桔梗种子的发芽势、发芽率、发芽指数,以0.100 mg/L浓度处理的效果最好,与对照相比,达到了0.01水平的极显著差异。NAA浓度0.010～0.100mg/L浸种能显著提高胚轴的伸长;NAA浓度1.000～10.000 mg/L浸种抑制胚根的伸长,当浓度达10.000 mg/L时,对洋桔梗种子的萌发有明显的抑制作用。[结论]低浓度的NAA能提高洋桔梗种子的发芽势、发芽率、发芽指数;高浓度NAA处理则抑制其种子的萌发。     

砂梨ACC合酶cDNA全长克隆及其反义与正义表达载体构建

为构建干扰砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)ACC合酶基因表达的遗传转化载体,利用RACE技术从'早生新水'成熟果实cDNA中克隆了ACC合酶的cDNA,该cDNA全长为1939bp,命名为Pyp-ACS,GenBank登录号为EF566865。Pyp-ACS核苷酸序列含有5′末端非翻译区109bp、1488bp完整的开放阅读框和3′末端非翻译区342bp(含25bp的Ploy (A))。Pyp-ACS编码495个氨基酸,与白梨(Pyrus×bretschneideri Rehd.)、西洋梨(Pyrus communisL.)、中国李(Prunus salicina Lindl.)、桃(Prunus persica(L.)Batsch)、梅(Prunus mume Seib.et Zucc.)、苹果(Malus×domestica Borkh.)和柿(Diospyros kaki Thunb.)有较高的同源性。该氨基酸序列具备ACC合酶7个保守区和组成该酶活性中心的12个氨基酸残基,即SLSKDMGFPGLR,进一步验证了克隆的正确性。以pYPX145载体为基础,分别将Pyp-ACS编码区序列反向和正向插入相应位点构建反义和正义表达载体,并分别命名为pPyp-ACS(-)和pPyp-ACS( ),目的基因由双35S启动子所控制。分别将这2个表达载体导入根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)EHA105,为耐贮藏转基因梨的遗传转化提供载体。     

洋桔梗组培苗玻璃化原因及恢复的研究

为了找出能够克服或降低洋桔梗组培苗玻璃化的最适培养条件,以YELLOW和PINK2个洋桔梗品种为试材,研究MS培养基中添加的激素、蔗糖、活性炭及温度对洋桔梗组培苗玻璃化的产生和恢复的影响.结果表明:品种、6-BA、NAA对洋桔梗玻璃化芽的产生均有影响,玻璃化率随6-BA及NAA浓度的增大而升高;适宜浓度的蔗糖对洋桔梗玻璃化芽的恢复有促进作用,但添加0.5 g·L~(-1)的活性炭及15 ℃的低温培养没有明显地促进作用.     

植物激素在洋桔梗组培快繁中的应用研究

研究了植物激素对洋桔梗试管苗生长、增殖的影响。结果表明:赤霉素(GA3)对试管苗茎的伸长生长有明显的促进作用,且以浓度0.8mg/L效果最好;MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/LIAA+0.8mg/LGA3的激素组合对促进试管苗高生长的效果最佳;6蛳BA对试管苗茎的伸长有抑制作用,而对新芽增殖有促进作用;对试管苗增殖促进作用最突出且可保证试管苗株高的培养基配方为MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+0.2mg/LIAA+0.8mg/LGA3。