向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法的研究

【目的】建立向日葵白锈病菌(Albugo tragopogi (Persoon) Schruter var helianthi Novotlenova)的巢式PCR检测方法。【方法】用通用引物NL1/NL4对采自伊犁的向日葵白锈病菌进行PCR扩增、克隆、酶切和测序,设计该病菌的特异性引物,用巢式PCR法检测供试样品。【结果】序列测定和比对结果表明,该病菌的核酸序列与GeneBank公布的向日葵白锈病菌核酸序列同源率为97%。针对该段基因设计向日葵白锈病菌的特异性引物ATHP3/ATHP4,用巢式PCR法对供试样品进行扩增,扩增片段为370 bp。【结论】成功建立了向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法。     

梨树CDPK基因家族进化和表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK或CPK)在植物生长和发育、逆境信号刺激及其对病原物的防御反应过程中发挥着非常重要的作用。本研究利用梨树全基因组数据,采用生物信息学的方法,在全基因组水平上对梨树CDPK基因家族进行系谱进化关系、基因结构、共线性关系及表达情况等分析。结果表明,梨树基因组中共存在31个CDPK基因,命名为PbCDPK1~PbCDPK31。系谱分析结果表明,这些CDPK基因归属于4个亚家族。共线性分析检测到12对CDKP基因间存在显著的共线性关系,其中10对由最近一次发生的全基因组复制事件形成。非同义/同义置换率的比率(dN/dS)说明CDPK基因在功能上进化得非常保守。荧光定量PCR结果发现,5个梨树CDPK基因对干旱逆境有响应。试验结果可为进一步开展梨树CDPK基因家族的功能鉴定和分子进化机制的研究提供参考。     

苹果脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）基因cDNA片段的克隆及序列分析

以皇家嘎拉苹果叶片为材料提取总RNA,合成cDNA第一链后,先利用巢式PCR获得苹果脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因中间片段,再利用3-′RACE方法进一步获得3′末端核酸序列,共得到840 bp包含完整3′末端的DHAR基因cDNA片段,其序列与烟草、水稻、番茄中DHAR基因序列的同源性均大于70%,证明所克隆到的核苷酸片段确为苹果DHAR基因cDNA片段。     

野生大豆新基因GsDabb1的克隆及其异源表达拟南芥的耐逆性分析

Dabb类蛋白是2000年被发现的一类新蛋白家族,具体功能特征尚不明确。以耐盐碱能力极强的东北野生大豆G07256为试材,根据前期得到的野生大豆碱胁迫基因芯片表达谱,从中筛选出一个碱胁迫处理下显著上调表达的Dabb类基因(probe set为Gma.16010.1.S1_at),通过电子克隆和RT-PCR获得该基因全长cDNA序列,命名为GsDabb1。序列分析表明,该基因在多个植物物种中均有同源基因,但功能尚不明确。通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)分析该基因在野生大豆高盐、低温、干旱胁迫下的表达模式,表明该基因能够响应多种非生物胁迫。为研究该基因在胁迫过程中的功能,将全长基因转化模式植物拟南芥,对转基因植株的表型分析结果显示,转基因拟南芥的耐旱性得到增强,表明该基因参与植物的耐旱过程,并能够提高植物耐旱性。研究得到对植物干旱胁迫抗性起重要作用的关键基因,为作物抗逆分子育种提供基因资源和奠定理论基础。     

中华补血草Syntaxin基因的克隆(英文)

[目的]对中华补血草Syntaxin基因进行克隆。[方法]以中华补血草叶片为材料,提取总RNA并进行反转录反应。依据已知Syntaxin基因5’端EST序列信息设计巢式引物,以反转录得到的cDNA为模板,利用2轮PCR扩增cDNA3’末端(3’RACE),获得Syntaxin基因3’端序列。[结果]获得1090bp的DNA片段。分析表明,该片段编码LsSyntaxin全长基因,其中开放阅读框长816bp,编码271个氨基酸。该基因编码的Syntaxin蛋白相对分子量为30254.3Da,理论等电点为5.55。[结论]为研究Syntaxin基因在补血草中的功能及其在补血草泌盐过程的作用奠定了基础。     

中华补血草Syntaxin基因的克隆

[目的]对中华补血草Syntaxin基因进行克隆。[方法]以中华补血草叶片为材料,提取总RNA并进行反转录反应。依据已知Syntaxin基因5'端EST序列信息设计巢式引物,以反转录得到的cDNA为模板,利用2轮PCR扩增cDNA3'末端(3'RACE),获得Syntaxin基因3'端序列。[结果]获得1090bp的DNA片段。分析表明,该片段编码LsSyntaxin全长基因,其中开放阅读框长816bp,编码271个氨基酸。该基因编码的Syntaxin蛋白相对分子量为30254.3Da,理论等电点为5.55。[结论]为研究Syntaxin基因在补血草中的功能及其在补血草泌盐过程的作用奠定了基础。     

小麦抗病基因同源序列(RGAs)的克隆与分析

RGA(抗性基因同源序列)法是克隆植物抗性基因的一种经济有效的方法,成为近年来的研究热点。本实验综合分析了拟南芥,西红柿,水稻,烟草等植物已克隆的抗性基因,并以这些抗性基因的NBS(核酸结合位点),LRR(富含亮氨酸重复),STK(丝氨酸/苏氨酸激酶)保守结构域设计并合成了几十对RGA引物,对小麦抗条锈病材料进行PCR扩增,获得以Xal-NBS为引物的R88RGA片段,经克隆和序列比对分析,发现该片段与逆境条件下植物抗病信号传导相关,与蛋白激酶同源性达到96%。此项研究对抗病机理的研究和基因的发掘有重要的指导意义。     

野生大豆新基因GsDabb1的克隆及其异源表达拟南芥的耐逆性分析

Dabb类蛋白是2000年被发现的一类新蛋白家族,具体功能特征尚不明确。以耐盐碱能力极强的东北野生大豆G07256为试材,根据前期得到的野生大豆碱胁迫基因芯片表达谱,从中筛选出一个碱胁迫处理下显著上调表达的Dabb类基因(probe set为Gma.16010.1.S1_at),通过电子克隆和RT-PCR获得该基因全长cDNA序列,命名为GsDabb1。序列分析表明,该基因在多个植物物种中均有同源基因,但功能尚不明确。通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)分析该基因在野生大豆高盐、低温、干旱胁迫下的表达模式,表明该基因能够响应多种非生物胁迫。为研究该基因在胁迫过程中的功能,将全长基因转化模式植物拟南芥,对转基因植株的表型分析结果显示,转基因拟南芥的耐旱性得到增强,表明该基因参与植物的耐旱过程,并能够提高植物耐旱性。研究得到对植物干旱胁迫抗性起重要作用的关键基因,为作物抗逆分子育种提供基因资源和奠定理论基础。     

基于巢式PCR的重叠延伸PCR优化

[目的]结合巢式PCR对重叠延伸PCR进行优化。[方法]以褐飞虱Actin 1基因启动子区与EGFP表达盒区基因融合为例,通过巢式PCR对重叠延伸PCR进行优化。[结果]成功获得融合片段,经过巢式PCR优化后大大简化试验流程,缩短试验时间,并增强PCR特异性与检出率。[结论]优化了重叠延伸PCR,可更快速高效融合基因片段。     

应用巢式PCR法鉴定牛早期胚胎性别

为获得一种高效的牛胚胎性别鉴定方法,采用高特异性和灵敏度的巢式PCR进行扩增。结果表明:公牛可以扩增出187bp的SRY基因片段和255bp的β-珠蛋白基因片段,母牛只能扩增出255bp的β-珠蛋白基因片段。巢式PCR只需3～8个细胞就可以观察到扩增结果,而常规PCR则需要较多的细胞,所以牛胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。     

甘蔗钙依赖蛋白激酶基因克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因(ScCDPK1),为其功能解析和育种利用打下基础。【方法】根据甘蔗cDNA文库中的CDPK基因序列信息设计引物,利用RT-PCR克隆ScCDPK1基因,并采用在线生物信息学分析软件对其推导蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽及保守结构域等进行预测分析。【结果】克隆获得的ScCDPK1基因完整编码区大小1650 bp,编码549个氨基酸,相对分子量61.971 kD,等电点(pI)6.78,不稳定指数35.63。同源性和遗传进化树分析结果显示,ScCDPK1基因与小麦TaCPK7基因亲缘关系最近,同源性达88%;ScCDPK1蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域(可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区),其二级结构主要由α螺旋(42.80%)和无规则卷曲(32.97%)构成;蛋白功能分类预测结果显示,ScCDPK1蛋白是一种阳离子通道蛋白,可能参与植物胁迫应答、信号转导和翻译调控等生物反应。【结论】ScCDPK1基因编码的蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域,是一种阳离子通道蛋白。     

猪胰岛素诱导1基因的cDNA克隆和差异表达及蛋白质序列分析

克隆猪胰岛素诱导1(INSIG1)基因,并对其蛋白质序列进行分析。根据人INSIG1基因的保守序列设计1对引物,以猪总RNA为模板,经RT–PCR获得INSIG1基因序列,通过相对荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达量;将INSIG1基因序列连接到pMD19–T Simple载体上,用PCR检测阳性克隆后测序,并对克隆得到的基因进行生物信息学分析。结果表明,INSIG1基因在肺中的表达量最高,其次是在肝脏,再次是在脾脏,在心脏中的表达量最低;通过克隆,获得了一段999 bp的序列,其中831 bp的开放阅读框编码276个氨基酸;该蛋白不含信号肽序列,与其他动物INSIG1基因氨基酸序列的一致性在71%以上。     

Beta-adrenergic receptor kinase: primary structure delineates a multigene family

The beta-adrenergic receptor kinase (beta-ARK), which specifically phosphorylates only the agonist-occupied form of the beta-adrenergic and closely related receptors, appears to be important in mediating rapid agonist-specific (homologous) desensitization. The structure of this enzyme was elucidated by isolating clones from a bovine brain complementary DNA library through the use of oligonucleotide probes derived from partial amino acid sequence. The beta-ARK cDNA codes for a protein of 689 amino acids (79.7 kilodaltons) with a protein kinase catalytic domain that bears greatest sequence similarity to protein kinase C and the cyclic adenosine monophosphate (cyclic AMP)--dependent protein kinase. When this clone was inserted into a mammalian expression vector and transfected into COS-7 cells, a protein that specifically phosphorylated the agonist-occupied form of the beta 2-adrenergic receptor and phosphorylated, much more weakly, the light-bleached form of rhodopsin was expressed. RNA blot analysis revealed a messenger RNA of four kilobases with highest amounts in brain and spleen. Genomic DNA blot analysis also suggests that beta-ARK may be the first sequenced member of a multigene family of receptor kinases.     

大豆TST基因的生物信息学及表达模式分析

TST为典型膜结合蛋白,具有高度保守序列,广泛存在于植物组织和细胞中。文章根据NCBI网站、Phytozomes数据库和MEGA软件分析大豆基因组中TST同源基因生物信息,发现大豆相关数据库中有8个大豆TST相关基因拷贝,其中5个TST基因与拟南芥和甜菜亲缘关系较近;通过实时荧光定量PCR分析大豆TST基因时空表达模式,确定GmTST2.1基因发挥拷贝作用;克隆GmTST2.1基因并分析其生物信息发现,GmTST2.1蛋白质由734个氨基酸组成,PI为5.1不稳定疏水性蛋白质,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲和片层结构组成,有典型N端跨膜结构域-中间胞质区-C端跨膜区结构域特征。研究分析GmTST基因生物信息学和表达模式,为进一步验证GmTST基因生物学功能提供借鉴和理论基础。     

The protein kinase complement of the human genome

We have catalogued the protein kinase complement of the human genome (the "kinome") using public and proprietary genomic, complementary DNA, and expressed sequence tag (EST) sequences. This provides a starting point for comprehensive analysis of protein phosphorylation in normal and disease states, as well as a detailed view of the current state of human genome analysis through a focus on one large gene family. We identify 518 putative protein kinase genes, of which 71 have not previously been reported or described as kinases, and we extend or correct the protein sequences of 56 more kinases. New genes include members of well-studied families as well as previously unidentified families, some of which are conserved in model organisms. Classification and comparison with model organism kinomes identified orthologous groups and highlighted expansions specific to human and other lineages. We also identified 106 protein kinase pseudogenes. Chromosomal mapping revealed several small clusters of kinase genes and revealed that 244 kinases map to disease loci or cancer amplicons.     

不同花生品种B06基因的克隆与序列分析

Dof（DNA binding with one finger）转录因子是一类植物特有的、进化上高度保守的基因家族，对植物多方面的生理过程均发挥调控作用。根据Dof家族中的一个B06基因的cDNA保守序列设计引物，对8个品种花生的B06基因进行PCR扩增克隆相似基因，并测定序列。实验成功克隆出四粒红和073103的完整...     

A calcium-dependent protein kinase with a regulatory domain similar to calmodulin.

Calcium can function as a second messenger through stimulation of calcium-dependent protein kinases. A protein kinase that requires calcium but not calmodulin or phospholipids for activity has been purified from soybean. The kinase itself binds calcium with high affinity. A complementary DNA clone for this kinase has been identified; it encodes a protein with a predicted molecular mass of 57,175 daltons. This protein contains a catalytic domain similar to that of calmodulin-dependent kinases and a calmodulin-like region with four calcium binding domains (EF hands). The predicted structure of this kinase explains its direct regulation via calcium binding and establishes it as a prototype for a new family of calcium-regulated protein kinases.     

团花树木葡聚糖转葡糖苷酶cDNA克隆及序列分析

以团花树形成层组织中大量表达的RNA为材料,通过反转录、保守区域PCR、3′RACE和染色体步移等技术获得了团花树AcXET的全长cDNA序列,共1396bp。核苷酸序列分析表明:该序列含有1个960bp的开放阅读框,编码1个由320个氨基酸组成的蛋白质。该基因编码蛋白与已报道的其他植物的XET蛋白有较高的同源性,且含有XET的活性催化位点EIDFE。     

Cloning of Thymidine Kinase Gene of Duck Plague Virus Using Degenerate PCR

The DNA of duck plague virus （DPV） thymidine kinase （TK） gene was cloned and sequenced from a vaccine virus in the study. Degenerate oligonucleotide primers for the consensus site of herpesvirus UL24, TK, and glycoprotein H（gH） gene were used in the polymerase chain reaction （PCR） to amplify DNA product with 3 741-base-pairs （bp） in size. DNA sequence analysis revealed a 1 077-base-pairs （bp） open reading frame （ORF） encoding a 358 amino acid polypeptide homologous to herpesvirus TK proteins. The predicted TK protein shared 31.2, 41.3, 35.7, 37.4, and 28.4% identity with herpes simplex virus typel, equine herpesvirus type 4, Marek＇s disease virus 2, herpesvirus turkey, and infectious laryngotracheitis virus, respectively. Comparison of the amino acid sequences of other herpesvirus TK proteins showed that these proteins were not conserved on the whole, otherwise the portion of the TK proteins corresponding to the nucleotide binding domain and the nucleoside binding site were highly conserved among herpesvirus. Comparison with the amino acid sequences of the conserved nucleotide and nucleoside binding domains of other eleven herpesvirus TK proteins to the predicted DPV peptide confirmed its identity as the DPV TK protein.