辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列的克隆及分析

[目的]从辣椒基因组中克隆Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列,分析其家族特性及进化关系.[方法]根据Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶保守区域设计简并引物,通过PCR扩增、回收、克隆、测序得到的目的基因序列.[结果]克隆从辣椒基因组14条逆转录转座子逆转录酶序列,序列大小均为340 bp左右.生物信息学分析表明,序列长度变化范围为310 ～345 bp,同源性范围为60.2;～99.1;.这些核苷酸序列具有较高的异质性,主要表现为终止密码子突变.聚类分析可将所得序列分为5大类,基于逆转录酶序列进行的不同物种进化树分析显示,第Ⅳ、Ⅴ类序列与荸荠、潘那利番茄等组成一大类,可能是逆转录转座子横向传递的结果.[结论]辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列具有普遍性、异质性等特点,与荸荠、潘那利番茄等物种的同类型逆转座子可能有相同的起源.     

四倍体野生种花生Ty1-copia类逆转座子逆转录酶基因的克隆与分析

克隆与分析四倍体野生种花生的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶基因序列,可为研究其转录活性、功能及调控提供序列基础。使用根据保守区设计的简并引物对,利用PCR技术对四倍体野生种花生(Arachis monticola)的基因组DNA进行扩增,经回收、克隆和测序,对目的序列进行生物信息学分析。结果显示,目的条带大小约260 bp,克隆获得了32条逆转录酶序列,序列长度范围为257～269 bp,A+T所占比例范围为54.47%～68.77%,A+T与G+C比例为1.20～2.20。核苷酸序列间相似性范围为46.4%～98.9%,存在较高异质性,表现为缺失突变与点突变;氨基酸序列间相似性范围为6.3%～100%,有12条序列发生了终止密码子突变,呈现高度异质性。绝大部分序列的保守基序一致,但各序列间的保守基序也存在一定差异,呈现一定程度的异质性。32条序列系统聚类为4个家族,家族Ⅰ和家族Ⅲ分别占总序列数的31.25%和37.50%。对四倍体野生种花生与其它物种植物同一类型逆转录酶的氨基酸序列构建系统发育进化树,结果显示所有序列被分为6类,其中,Ⅰ类和Ⅱ类分别包含15条和9条四倍体野生种花生逆转录酶序列,表明四倍体野生种花生逆转录酶序列具有比较高的保守性;同时四倍体野生种花生逆转录酶序列与葡萄、拟南芥、马铃薯、野茶树、辣椒、甜菜、烟草、番茄、绿豆以及欧洲云杉等具有较近的亲缘关系,表明它们之间可能存在横向传递。本研究获得的逆转录酶序列为基于LTR逆转座子的花生属分子标记开发和应用奠定了基础。     

AA染色体组野生种花生Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶序列的多样性

以2份AA染色体组野生种花生为试验材料,扩增分离Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶序列,分析其序列特征、多样性及进化关系。利用根据Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶的保守区设计的简并引物进行PCR扩增,对目的条带进行回收、克隆和测序后,对逆转录酶序列进行生物信息学分析。目的条带大小均约为430 bp,分别从2份AA染色体组野生种花生材料中分离到32、33条逆转录酶序列,对于65条逆转录酶序列,其长度变化范围为397～440 bp, A+T所占比例范围为56.48%～68.14%,(A+T)/(G+C)为1.3～2.13,核苷酸序列间相似性范围为62.6%～97.9%;65条逆转录酶序列被划分为9个家族,其中家族Ⅰ为主要成分;翻译成氨基酸后,序列间相似性范围为12.4%～98.6%,相比核苷酸序列,氨基酸序列表现出更高的异质性;65条逆转录酶序列中有26条发生了无义突变,2份野生种花生材料的无义突变发生率相当;序列间保守基序大体一致,但也发生了一定的变异,呈现出一定的异质性;9个家族所选代表序列的蛋白质结构总体类似,但也在螺旋结构数、折叠结构数、转角数、氢键数、α-螺旋数、β-折叠数...     

早酥梨及其红色芽变Ty1-copia反转录转座子逆转录酶的克隆与分析

【目的】从早酥梨及其红色芽变基因组中克隆Ty1-copia反转录转座子逆转录酶序列,分析其特点和差异。【方法】根据Ty1-copia反转录转座子逆转录酶保守区域设计简并引物,建立并优化PCR扩增体系,回收、克隆、测序得到的目的基因序列。【结果】成功从早酥梨基因组和红色芽变材料中分别获得29,30条逆转录酶序列,序列大小均为260bp左右。生物信息学分析表明,与早酥梨相比,红色芽变的逆转录酶序列多发生终止子突变、缺失突变、替换突变。聚类分析可将所得序列分为7个家族,基于逆转录酶序列进行的不同物种进化树分析显示,第7家族序列与苹果和李具有很高的同源性,可能是反转录转座子横向传递的结果。【结论】早酥梨及其红色芽变Ty1-copia反转录转座子逆转录酶序列具有普遍性、异质性等特点,虽均已不具备转录活性,但红色芽变的逆转录酶序列突变程度更高。     

水稻gypsy类逆转座子对不同胁迫条件的响应

LTR类逆转座子是水稻基因组中数量最多，分布最广的转座元件，其中Ty3-gypsy类的比重较大。根据Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶的保守区域，采用简并引物通过RT-PCR从5种胁迫处理后的水稻品种月亮谷的cDNA 进行了扩增，并测序获得了一批转录片段，分析不同胁迫条件诱导激活的Ty3-gypsy类逆转座子的特点。结果表明，5种胁迫处理都能诱导月亮谷中Ty3-gypsy类逆转座子的表达；对不同胁迫响应的逆转座子序列大部分同源性较高且呈交叉分布，仅有少部分具有胁迫响应的特异性，说明很多Ty3-gypsy类逆转座子能对不同胁迫进行响应。     

石刁柏Ty1-copia反转座子逆转录酶序列克隆及异质性分析

对石刁柏(Asparagus officinalis)品种UC309及TD818的两个反转座子逆转录酶序列进行了PCR扩增并对其在基因组中的异质性进行了分析。结果表明,s101366和s107518两个转座子序列均属于Ty1-copia反转座子,是Ty1-copia反转座酶的部分保守区序列,其长度分别为636和653 bp。对随机获得的两个反转座子测序表明两个反转座子存在一定的异质性,其突变主要是由于发生了碱基置换,其中碱基转换分别占到80.4%和80.0%,T圮C和G圮A转换的比例差异不显著。通过对两个石刁柏品种(TD818和UC309)中获得的序列聚类分析发现,s101366和s107518均未表现出性别间、品种间及近缘种间的保守性,甚至表现出了种内异质性大于种间的异质性特征。这说明了两个反转座子处于高度变异的状态,是产生染色体不稳定的重要因素之一。     

萝卜IRAP技术体系建立与品种指纹图谱构建

为建立萝卜逆转座子间扩增多态性(IRAP)技术体系,基于萝卜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的保守序列设计引物,对IRAP-PCR反应主要因素进行分析。建立的萝卜IRAP标记技术体系(20μl)为:20 ng基因组DNA模板,1×PCR buffer,0.25 mmol/L d NTPs,2.0 mmol/L Mg2+,0.4μmol/L引物,1 U Taq DNA聚合酶。将所建立的IRAP标记技术体系应用于14个萝卜品种指纹图谱分析,结果显示,筛选出的2个特异引物Rs Ty1F5和Rs Ty1F10在14份萝卜材料中共扩增得到了16个多态性条带,可以将14份萝卜材料完全区分开,每份种质都有独特的指纹图谱,表明IRAP技术可以有效地应用于萝卜种质鉴定和指纹图谱的构建。     

苹果IRAP反应体系的建立和指纹图谱构建

利用已获得的苹果Ty1-copia类逆转座子LTRs建立了苹果逆转座子间扩增多态性(IRAP)技术体系,对影响IRAP-PCR扩增结果的若干因子进行了研究.优化的反应体系包含:2.5 μL 10×buffer,50 ng模板DNA,2.5 mmol·L-1 Mg2+,0.2 mmol·L-1 dNTPs,0.4 μmol·L-1引物,1 U Taq DNA聚合酶,反应体积为25 μL;优化的PCR扩增程序为:94℃ 2 min; 94℃ 1 min,退火1 min,72℃ 2 min,循环35次;72℃延伸10 min;退火温度根据引物温度设定.该IRAP体系分别用于‘元帅'和‘富士'的短枝和着色芽变指纹图谱的分析,构建的指纹图谱可以作为芽变鉴定的依据,表明这些突变可能系逆转座子转座插入或逆转座子间重组所致.     

黄瓜SSAP标记技术的建立

基于黄瓜Ty1-copia类逆转座子的长末端重复序列信息,通过引物设计、选择性扩增体系筛选以及银染显色技术等,建立起了适合黄瓜的SSAP(sequence-specific amplification polymorphism)标记技术体系。通过与AFLP标记比较,确定SSAP标记具有更高的多态性检测效率。进一步将该SSAP标记系统用于不同生态型黄瓜材料间的多态性分析,发现该标记系统能有效地探测不同栽培黄瓜品种间的多态性。     

油菜脂肪酸延长酶基因fae1片段的克隆与SNP分析

 脂肪酸延长酶基因fae1是调控油菜芥酸合成的关键基因。本研究利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物，通过多聚酶链式反应（PCR）从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜（包括2个人工合成种）的12个不同品种中扩增出长1 007bp的fae1基因片段。PCR产物经与克隆载体pGEM-T vector连接和序列测定，获得12个品种的fae1基因片段的DNA 序列。对来自12个不同品种的fae1基因序列进行比较分析表明：fae1基因具有高度序列保守性，扩增长度均为1 007 bp，核苷酸序列相似度达98%以上，氨基酸序列的保守性更高。在1007 bp的区间内共发现23个SNP(single nucleotide polymorphism)位点，其中有11个单核苷酸变异导致了编码氨基酸的改变。人工甘蓝型油菜和天然甘蓝型油菜的fae1基因片段未发现明显差异。发现了高芥酸品种与低芥酸品种的fae1基因、以及A基因组与C基因组的fae1基因特有SNP位点。     

“大通＂牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析

乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）是从乳铁蛋白（LF）上被胃蛋白酶水解下来的25个氨基酸残基的小肽,位于乳铁蛋白第二外显子,是乳铁蛋白的抗菌活性中心,其抗菌活性是LF的几百倍。Lfcin具有广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效,同时具有抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、参与免疫调节等多种生物学功能和维持动物肠道菌群正常生态稳定的功能,从而起到提高动物生产性能的作用。     

稻曲病菌致病力丧失突变菌株B-1015的T-DNA标记基因的克隆

【目的】研究稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）致病力丧失突变菌株B-1015,克隆和分析T-DNA插入位点的侧翼序列,为稻曲病菌的致病机制研究提供参考。【方法】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体B-1015菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率以及致病力等生物学表型。用PCR检测T-DNA在B-1015基因组中插入的稳定性,用Southern杂交检测T-DNA插入的拷贝数,用hiTail-PCR扩增T-DNA侧翼序列,用RACE PCR克隆T-DNA标记基因,半定量RT-PCR分析所克隆基因的表达情况。【结果】与野生菌株P1相比,突变菌株B-1015的生长速率和产孢量都有较明显的降低,孢子萌发率无明显差异,致病力丧失。分子检测结果表明T-DNA在B-1015基因组中为稳定的单拷贝插入。hiTail-PCR得到的T-DNA两端侧翼序列在野生型菌株基因组上不相连,RACE PCR在两边的侧翼序列上分别克隆得到Uvt-1015R和Uvt-1015L。预测分析表明Uvt-1015R包含一个长度为948 bp的开放阅读框（open reading frame finder,ORF）,可编码295个氨基酸,5′端非编码区（5′-untranslated regions,5′-UTR）长度为 341 bp,3′端非编码区（3′-untranslated regions,3′-UTR）长度为271 bp。Uvt-1015L包含一个长度为351 bp的ORF,可编码116个氨基酸,5′-UTR为31 bp,3′-UTR长度为174 bp。在已知功能的蛋白中检索,没有发现与Uvt-1015R和Uvt-1015L基因同源的蛋白。序列分析发现T-DNA插入在两个基因序列中间,RT-PCR结果显示,在突变菌株B-1015中,Uvt-1015R表达量下降,Uvt-1015L不表达。【结论】 稻曲病菌突变菌株B-1015致病力等重要生物学表型发生改变,可能是由于T-DNA的插入导致了B-1015基因组重排和Uvt-1015R、Uvt-1015L基因结构的破坏。     

猪胰岛素诱导1基因的cDNA克隆和差异表达及蛋白质序列分析

克隆猪胰岛素诱导1(INSIG1)基因,并对其蛋白质序列进行分析。根据人INSIG1基因的保守序列设计1对引物,以猪总RNA为模板,经RT–PCR获得INSIG1基因序列,通过相对荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达量;将INSIG1基因序列连接到pMD19–T Simple载体上,用PCR检测阳性克隆后测序,并对克隆得到的基因进行生物信息学分析。结果表明,INSIG1基因在肺中的表达量最高,其次是在肝脏,再次是在脾脏,在心脏中的表达量最低;通过克隆,获得了一段999 bp的序列,其中831 bp的开放阅读框编码276个氨基酸;该蛋白不含信号肽序列,与其他动物INSIG1基因氨基酸序列的一致性在71%以上。     

果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因的多样性分析

【目的】分析Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶基因（RT）序列特征、多样性、系统进化关系及转录活性，为深入研究果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子全长序列、转录转座活性及生物学功能提供理论参考。【方法】以果蔗品种拔地拉为试材，根据Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因保守区设计简并引物对，利用其进行PCR扩增，将目的条带回收纯化后连接至pMD18-T载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。依据测序结果对RT基因序列进行生物信息学分析。【结果】从果蔗拔地拉中扩增获得51条序列（SoRT4-1~SoRT4-51），去除重复序列和非RT基因序列后共获得44条RT基因序列，长度为423~433 bp，AT含量为56.84%~64.97%，AT:GC比值为1.32~1.85，核苷酸序列间相似性为44.4%~99.3%，其编码的氨基酸序列间相似性为10.8%~100.0%，说明氨基酸序列比核苷酸序列表现出更高异质性。44条RT基因序列被划分为4个家族，其中Ⅰ和Ⅲ为主要家族。44条RT基因编码的氨基酸序列中有20条发生了无义突变，说明其突变率较高。44条RT基因编码蛋白序列存在5种保守基序，其中，有29条序列同时包含Motif 1~Motif 4，其余15条序列的保守基序变异较大，说明保守基序存在一定异质性。4个家族代表性序列编码蛋白的三级结构在氢键和转角的数量方面差异较大；系统发育进化树分析结果显示，44条RT基因序列被分为七大类，Ⅰ类和Ⅱ类中的果蔗RT基因序列分别占序列总数的40.91%和27.27%，Ⅱ类和Ⅵ类中的部分果蔗RT基因序列与拟南芥的BAB40828.1、粳稻的BAB40824.1、菠菜的BAB40833.1和大豆的BAB40834.1亲缘关系较近，推测这些物种在进化过程中发生了Ty3-gypsy类反转录转座子的横向传递。初步发现1条Ty3-gypsy类反转录转座子（SoRT4-40）具有转录活性。【结论】获得44条果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因序列，其中仅有1条序列具有转录活性，这些RT基因序列可用于开发基于Ty3-gypsy类反转录转座子的甘蔗分子标记。     

苹果ACO1转录因子MdHB1基因的克隆及其真核表达载体的构建

【目的】通过生物信息学分析,将苹果的一段EST序列初步定性为转录因子MdHB-1基因,对该基因进行克隆和真核表达载体构建,为进一步研究其分子生物学功能奠定基础。【方法】根据番茄LeACO-1转录因子LeHB-1的基因序列,对苹果EST库进行Blast,获得一段EST序列,根据该EST序列设计1对特异性引物,以“皇家嘎啦”苹果花器总RNA为材料,经RT-PCR得到1条长约1 000 bp的cDNA片段,T/A 克隆后进行序列测定及分析。将基因MdHB-1与真核表达载体pPICZA连接,构建真核表达载体pPICZA-MdHB-1,并导入毕赤酵母菌种GS115,通过 PCR鉴定该载体的导入情况。【结果】克隆到苹果MdHB-1基因(GenBank登录号为JQ678788),其开放阅读框为1 011 bp,编码336个氨基酸。Blastn和Blastp序列比对分析发现,MdHB-1与已登录的其他物种的HB-1基因相似性达50%～60%。该基因编码的氨基酸中存在保守序列HD-Zip结构域,该保守序列与已经报道的番茄LeHB-1、拟南芥AtHB-1的保守序列的同源性均大于85%。重组表达载体PICZA-MdHB-1构建正确并已成功导入酵母基因组中。【结论】成功克隆了苹果转录因子MdHB-1基因全长,并正确构建了其真核表达载体。     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因cDNA的克隆及序列分析

[目的]为研究以鼠兔LDH-C4为靶蛋白的节育型鼠药奠定基础。[方法]采用简并引物PCR克隆得到黑唇鼠兔LDH-C基因的EST序列,再根据EST序列采用RACE技术克隆出基因的开放阅读框（ORF）全长,和3’UTR序列。[结果]整个cDNA全长1 498 bp,其中ORF长996 bp,编码332个氨基酸,3’UTR长486 bp。ORF序列比对显示LDH-C基因在大的分类单位上均很保守。系统树分析显示黑唇鼠兔的LDH-C基因和灵长类及偶蹄目的遗传距离较近,和啮齿目较远。[结论]成功的克隆得到了黑唇鼠兔的LDH-C基因的cDNA序列。