SQR基因在Nisin抗性乳酸乳球菌中的表达

为了研究硫化物-醌氧化还原酶(SQR)基因的乳酸菌表达载体pLEB590-SQR的构建及其在乳酸乳球菌MG1363中的表达,通过限制性内切酶酶切载体pLEB590与目的片段SQR,回收纯化并用T4连接酶进行连接,连接产物通过电转化法转化到乳酸菌中,提取所得到的乳酸乳球菌质粒pLEB590-SQR进行双酶切鉴定与普通PCR鉴定;并通过电转化将重组质粒导入乳酸乳球菌MG1363中,在含有Nisin(乳酸链球菌素)的选择培养基中筛选阳性克隆,采用SDS-PAGE电泳和Western杂交检测SQR蛋白质的表达情况。最后检测重组质粒在MG1363中的遗传稳定性。结果显示,SQR乳酸菌重组表达载体pLEB590-SQR构建成功,从MG1363中成功检测到目的蛋白质SQR的表达,携带pLEB590-SQR的MG1363遗传稳定性达90%以上。乳酸乳球菌MG1363可以用来表达硫化物-醌氧化还原酶(SQR)。     

SQR基因在大肠杆菌和乳酸菌中的表达

为了研究硫化物-醌氧化还原酶(SQR)基因的乳酸菌表达载体pMG36e-SQR-Myc的构建及其在大肠杆菌DH5a和乳酸菌MG1363中的表达,通过限制性内切酶酶切大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e与目的片段SQR-Myc,回收纯化并用T4连接酶进行连接,连接产物通过KCM法转化到大肠杆菌DH5a中,提取所得到阳性大肠杆菌菌株质粒pMG36e-SQR-Myc进行双酶切鉴定与普通PCR鉴定;并通过电转化将重组质粒导入乳酸菌MG1363中,采用SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测SQR蛋白质在其中的表达情况。结果显示,SQR乳酸菌重组表达载体pMG36e-SQR-Myc被成功构建,目的蛋白质SQR在大肠杆菌和乳酸菌MG1363中被成功检测到。因此,乳酸菌MG1363可以用来表达硫化物-醌氧化还原酶(SQR)。     

小鼠DAZL基因启动子核心区域分析及甲基化对其启动活性的影响

旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制。采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到p EGFP-N1和p GL3-Basic载体,构建重组载体。将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化。双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370~-36 bp,在-370~-166 bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性与对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著。本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考。     

基于鸡卵清蛋白启动子的纳豆激酶慢病毒表达载体表达特性的研究

纳豆激酶(nattokinase,NK)是一种有效的抗血栓药物。基于已构建的纳豆激酶慢病毒表达载体,旨在比较其在鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞中特异性表达的有效性。提取含卵清蛋白启动子(ovalbumin promoter,OV2)和雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)的pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP重组质粒。通过PCR和双酶切进行初步鉴定,经生物公司测序、包装和滴定得转染传代培养的鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞,并采用荧光显微镜和qPCR法检测细胞表达产物。结果表明,载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP构建成功;且荧光显微镜下,鸡输卵管上皮细胞的绿色荧光多于成纤维细胞;qPCR检测发现NK正常表达。提示成功构建纳豆激酶慢病毒表达载体且在鸡输卵管上皮细胞中正常表达。     

重组人gdnf在人乳腺肿瘤上皮细胞中表达的研究

为了在人乳腺肿瘤上皮细胞系中表达重组人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体,用脂质体介导法将其导入人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞中,经G418抗性筛选8~10 d后,分离稳定表达红色荧光蛋白的转染细胞,PCR鉴定转基因细胞,用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,RT-PCR和Western Blot检测重组人GDNF的表达分泌。结果表明:重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体被成功构建,转染Bcap-37细胞后,稳定整合到细胞染色体中,转基因细胞经激素诱导后能够表达分泌糖基化的GDNF,为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白用于帕金森病临床治疗研究奠定了基础。     

转运真核表达盒的重组T7噬菌体构建

为了构建转运真核表达盒的重组T7噬菌体,并分别在体外、体内条件下检测其标签蛋白质EGFP的表达。以T7噬菌体基因组左侧578 bp处为插入位点,取上游400 bp和下游200 bp片段作为左右同源臂,并在其中插入表达EGFP基因的真核表达盒(EEB),构建同源重组质粒p UC-L-EEB-R。将该质粒载体转化T7噬菌体宿主细菌BL21,在噬菌体繁殖过程中完成同源重组,PCR筛选重组T7-EEB噬菌体。提取该重组噬菌体基因组转染Vero细胞后体外检测EGFP蛋白质表达,纯化的噬菌体免疫小鼠后体内检测EGFP蛋白质表达。结果显示,通过同源重组方法成功构建了携带真核表达盒的重组T7噬菌体,PCR检测和酶切鉴定均证明表达盒已正确插入。T7-EEB基因组转染真核细胞可见明显的EGFP蛋白质表达,免疫小鼠后活体荧光检测到EGFP蛋白质信号,在小鼠肝脏、脾脏组织中RT-PCR检测到EGFP基因的mRNA转录。表明同源重组方法可以用于构建重组T7噬菌体,噬菌体能够转运真核表达盒并实现蛋白质表达。     

利用2型重组腺相关病毒抑制子宫腔上皮Plekhs1基因表达对小鼠生育能力的影响

研究构建稳定表达Plekhs1 shRNA 2型重组腺相关病毒载体(rAAV2-GFP-shRNA-Plekhs1),筛选并制备抑制Plekhs1表达效果最强重组腺相关病毒(rAAV2-PL3)。重组病毒子宫角注射到小鼠子宫,通过Real-time PCR、荧光检测、免疫组化技术检测rAAV2-PL3在小鼠子宫侵染表达规律,分析rAAV2-PL3侵染小鼠子宫抑制Plekhs1表达效果及对生殖影响。结果表明,rAAV2-PL3可有效转染至小鼠子宫内膜上皮细胞中并抑制Plekhs1表达,F1代产仔数量显著降低。研究表明,子宫角注射重组腺相关病毒可高效研究子宫腔上皮基因功能。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。     

奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控

【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。     

大鼠OSP-1启动子克隆与表达检测

[目的]克隆大鼠卵巢特异性启动子（OSP-1）片段,并在细胞水平检测该启动子调控标记基因的组织特异性表达。[方法]参考已知大鼠OSP-1序列设计特异性引物,PcR扩增大鼠OSP-1启动子片段并与已公布的大鼠OSP—1序列进行比较。将OSP-1启动子定向克隆到去除CMV的pEGFP—N1载体,构建真核表达载体pOSP—1—EGFP．N1;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000介导下,分别转染水牛的颗粒细胞、乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞,并于转染后12,24和48h在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。【结果lOSP—l启动子扩增片段长480bp,与已公布的大鼠OSP-1序列的相似性达96％;应用启动子预测软件对所得序列分析表明,该扩增片段含有类似于TA—TAbox和CAATbox的核心启动顺式元件,并含有多个C／EBPbeta转录因子的结合位点;在颗粒细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大,48h荧光细胞数量骤减,且死细胞增多;在乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞均未检测到EGFP基因表达。[结论]大鼠OSP-1启动子控制下的EGFP基因可在水牛颗粒细胞中特异表达,为构建水牛卵巢特并性表达转基因载体奠定了基础。     

牛膝多糖对仔猪肠道微生物及小肠黏膜形态的影响

选用28日龄、体重相近(8.898±0.742)kg,健康的DLY(杜洛克×长白×大白)断奶仔猪160头,随机分为5个组,采取单因子试验设计,对照组、试验Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ组分别饲喂添加0,0.01%抗生素,0.05%牛膝多糖、0.1%牛膝多糖、0.15%牛膝多糖的试验日粮,试验期28 d.每个处理4个重复,每个重复8头猪.结果表明:试验组在抑制肠道大肠杆菌和促进肠道双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖效果明显好于对照组(P<0.05或P<0.01);牛膝多糖试验组在抑制肠道大肠杆菌和促进肠道有益菌方面达到或显著好于添加抗生素试验组;随着牛膝多糖添加量的增加,其抑制肠道大肠杆菌和促进肠道有益菌的效果逐渐提高,Ⅱ和Ⅳ组之间差异显著或极显著(P>0.05,P<0.05或P<0.01).各试验组之间的十二指肠段上皮细胞层厚度无显著性差异;试验Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ组随着牛膝多糖添加量的增加,回肠段和空肠段的上皮细胞层厚度增加,显著或极显著大于对照组和试验Ⅰ组(P<0.05或P<0.01);与对照组相比,试验Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ组显著增加肠绒毛高度和降低隐窝深度(P<0.05或P<0.01);试验Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ组在增加十二指肠段肠绒毛高度和降低隐窝深度方面明显好于试验Ⅰ组(P<0.05或P<0.01);各试验组回肠和空肠的隐窝深度之间没有显著性差异;试验Ⅲ和Ⅳ组间小肠黏膜形态没有显著性差异.     

鸡肠道组织中血管活性肠肽的分布特点

为探讨鸡肠道组织中肽能神经支配的途径及其功能,运用免疫组织化学超敏SP法,对不同生长阶段鸡肠道中血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)的分布特点进行了研究。结果显示,肠壁中VIP的表达范围较为广泛,涉及黏膜上皮和固有层、肌层和外膜,尤以固有层和肌层最为典型;随着日龄增加,黏膜上皮间VIP阳性细胞数量逐渐增多;从肠道不同部位的分布来看,十二指肠中VIP的表达强于同时期其他部位,空肠中的表达次之,回肠和盲肠的表达相对较弱。黏膜固有层和肌层一直分布有染色较深的VIP阳性神经纤维,呈串珠状、细线状或膨体状。提示鸡肠道是产生VIP的又一个重要部位,肠道中的VIP可参与鸡免疫器官的功能调节,并作为一种信息分子介导神经内分泌系统和黏膜免疫系统之间的相互作用。     

DGGE技术优化及其在肠道微生态研究中的应用

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种非培养微生物研究方法,克服了实验室传统的微生物分离、培养和分类方法的局限性,是研究动物肠道微生态群落的重要手段之一。介绍了DGGE的技术原理和系统优化及其在动物肠道微生态研究中的应用和自身存在的局限性,并对其应用前景进行了展望。     

桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的种类及分布

对47头野外采集的桑粒肩天牛幼虫肠道进行定性与定量检测,发现了13种菌群。其中葡萄球菌属在前中肠、中中肠、后中肠和后肠中的分离率为100%,是常住菌群。链球菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属和芽孢杆菌属在上述4个肠段都能分离到,但分离率较低。而其他菌群只能在某些肠道分离到,为过路菌群。各个肠段菌群菌量分布不同,即后中肠<中中肠<前中肠<后肠。葡萄球菌属菌量在各肠段分布同总的菌群菌量一致。可见葡萄球菌属在桑粒肩天牛生长发育过程中起了积极的作用。     

断奶仔猪血清及肠道肠三叶因子ITF水平与腹泻的关系研究

观察仔猪断奶后一周的腹泻情况,比较民猪和长白猪的腹泻程度。用ELISA方法检测断奶仔猪血清和肠道肠三叶因子(Intestinal trefoil factor,ITF)浓度,分析断奶后ITF水平变化与仔猪断奶腹泻的关系。结果表明,断奶后一周内,民猪腹泻率、腹泻频率和腹泻指数均小于长白,提示民猪比长白具有更好的抵抗腹泻的能力。断奶后仔猪血清和肠道ITF水平发生了显著变化,健康组仔猪血清ITF含量极显著上调(P<0.01),腹泻组肠道ITF水平在空肠和盲肠显著上调(P<0.05),而健康组肠道ITF水平相对较稳定,提示ITF与仔猪断奶腹泻有重要关系,断奶仔猪维持肠道较稳定的ITF水平,是保证肠道健康,减少腹泻发生的重要生理基础。     

脱细胞羊膜与小肠黏膜下层对大鼠皮肤缺损修复中表皮干细胞的影响

目的 观察脱细胞羊膜(HAM)与小肠黏膜下层(SIS)促进大鼠皮肤缺损修复中表皮干细胞的作用.方法 SD大鼠24只,在两侧背部各做1个直径为1.8 cm圆形全层皮肤缺损.创面随机分为A组、B组和C组.A组HAM覆盖,B组SIS覆盖,C组纱布覆盖.在2周时处死动物取材,HE染色观察皮肤缺损修复情况.免疫组织化学染色检测角...     

混合益生菌对仔猪生长及肠道菌群的影响

选用50头体重相近的三元杂交断奶健康仔猪,随机分为5组:对照组全程饲喂玉米-豆粕型基础日粮;试验1、2、3、4组在试验第1天到第28天分别饲喂基础日粮+蜡样芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和戊糖乳杆菌(质量比为1∶1∶1、1∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶2)的混合益生菌制剂,在第29天到第42天饲喂基础日粮。饲喂28 d后计算各组仔猪日增重、料重比、腹泻率。结果表明:4个试验组仔猪的日增重均高于对照组,料重比均低于对照组,腹泻率均显著低于对照组;试验1、3组仔猪的日增重显著高于对照组,且试验1组仔猪的日增重又稍高于试验3组;试验1、3组仔猪的料重比显著低于对照组,而试验1组仔猪的料重比又稍低于试验3组;试验1组和3组仔猪的腹泻率相同,且低于试验2组和4组,表明4种比例混合的益生菌制剂均能促进仔猪生长,且以质量比1∶1∶1、2∶1∶2混合的益生菌制剂促进仔猪生长的效果较好;对试验1组和对照组仔猪在试验0、7、14、21、28、42 d肠道内菌群的定量PCR结果表明,试验1组仔猪肠道内蜡样芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌数量在饲喂益生菌制剂期间呈现一致的变化趋势,即先上升后下降,再上升,而对照组3种菌的变化趋势不一致;在停喂益生菌制剂2周后,3种益生菌仍呈规律变化,表明饲喂益生菌制剂能够调节仔猪肠道相应菌群的生长;对仔猪肠道粪样菌群的16SrDNA的特异序列的进行变性梯度凝胶电泳及抠胶测序的结果表明,仔猪在饲喂益生菌制剂7 d后,肠道蜡样芽孢杆菌、肠球菌、链球菌、双歧杆菌、戊糖乳杆菌、大肠杆菌、鼠李糖乳杆菌菌群数量均下降,到第28天时,各种菌群数量均上升,表明饲喂益生菌制剂不仅能调节仔猪肠道相应益生菌的生长,还能调节肠道肠球菌、链球菌、大肠杆菌与双歧杆菌的生长。     

花叶病毒侵染的果蔗(Badila)的基因表达

采用荧光标记差异显示技术(d ifferential d isp lay,简称DD-PCR)对甘蔗花叶病毒(Sugarcane m osaic virus,SCMV)侵染的果蔗(Bad ila)基因表达进行研究.用随机筛选出的23对引物组合扩增出9条差异条带,其中4条是有明显差异表达的cDNA条带,5条是表达强弱的差异条带.同时对一些影响荧光标记DD-PCR的因素进行了分析.     

麦蛾气味受体OrCo基因的克隆及其表达模式分析

为提高麦蛾茧蜂种群的室内扩繁效率,采用人为控制种蜂婚配条件,研究麦蛾茧蜂交配经历和种蜂性比对交配行为及子代性别分化的影响。结果表明:麦蛾茧蜂种蜂交配经历对雌雄交配行为具有显著影响。交配经历较少的雄蜂再行配对时,求偶次数和交配次数较多、求偶强度较强且单次交配时间较长。没有交配经历的雄蜂比有5~6次交配经历的雄蜂交配时间显著要长。麦蛾茧蜂雄蜂交配经历对子代雌雄性比具有一定影响,但对子代总蜂数量的影响不明显。较少交配经历的雄蜂与处女雌蜂交配繁育所获子代雌蜂数量较多,雌雄性比较高。室内人工繁殖时,适当提高麦蛾茧蜂种蜂中雄蜂的比例有助于提高子代雌蜂数,当种蜂性比为1雌3雄,益害比为2(雌蜂数)10时繁殖效率最佳。     

IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达

构建含有传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)VP2/4/3和鸡白细胞介素2(Chicken Interleukin 2,ChIL-2)融合基因的真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,并在Vero细胞中进行表达.应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension),分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-IL-2、IL-2-VP2/4/3,定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,在脂质体介导下,分别转染Vero细胞.RT-PCR检测证实导入的外源基因在Vero细胞中得到了转录;间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot检测证实重组质粒在Vero细胞中正确表达了插入的外源基因编码的融合蛋白,且表达的融合蛋白具有免疫反应性.重组真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3的成功构建及其在Vero细胞中的有效表达,为进一步探讨ChIL-2作为分子免疫佐剂对IBDV DNA疫苗的特异性免疫增强作用奠定了基础.