百脉根结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2的转录激活作用

共生结瘤过程是根瘤菌与宿主植物交换信号分子的相互作用过程,结瘤信号通道蛋白基因NSP1和NSP2是结瘤因子诱导的共生信号转导途径的必要元件。LjNSP1和LjNSP2蛋白都包含植物所特有的GRAS结构域,推测为转录调节子,但缺乏明确的生化证据。为验证这一推测,本研究采用酵母双杂交系统,将两者分别融合到酵母GAL4转录因子的DNA结合结构域上,根据是否能激活报告基因的表达来验证它们的转录激活能力。结果表明LjNSP1和LjNSP2在酵母体内均具有转录激活的能力。为进一步确定转录激活的区域,对LjNSP1和LjNSP2构建了一系列的缺失突变,鉴别出转录激活区段均位于两者的N-末端的可变区域。为验证作为转录因子的LjNSP1和LjNSP2是否具有结合某种特定基因的启动子的能力,进行了酵母单杂交实验。其结果表明,LjNSP1和LjNSP2蛋白均能够结合根瘤起始基因NIN的启动子,但不能结合钙离子结合蛋白基因CBP1的启动子。     

百脉根离子通道蛋白Pollux与翻译延伸因子EF1A的相互作用

利用酵母双杂交技术,以百脉根离子通道蛋白Pollux胞内结构域为诱饵,从百脉根AD-cDNA文库中筛选到与Pollux相互作用的多个阳性克隆,经DNA序列测定及NCBI数据库BLAST分析,其中有6个阳性克隆编码翻译延伸因子EF1A。进一步在大肠杆菌中表达与纯化Pollux和EF1A融合蛋白,通过Pull-down及Western杂交证实Pollux胞内结构域与EF1A的C-末端相互作用。     

百脉根起始结瘤相关转录因子间相互作用的鉴定

以模式豆科植物百脉根为材料,利用酵母双杂交和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation ,BiFC）技术,研究调控起始结瘤基因表达的转录因子IPN2、NSP2、CYCLOPS、DELLA间的相互作用。结果显示,百脉根IPN2与DELLA、NSP2与DELLA、CYCLOPS与DELLA均有相互作用。表明IPN2、DELLA可能参与并形成一个大的蛋白复合物,网络调控豆科植物起始结瘤基因的时空表达。     

百脉根AD-cDNA文库的构建及与结瘤因子受体NFR1相互作用蛋白的鉴定

以豆科植物百脉根为材料,构建了AD-cDNA表达文库。其库容量达到每3μg DNA 2×106酵母转化子,空载率为12.5%,平均片段长度为1.5 kb。以百脉根结瘤因子受体激酶基因1(nod factor receptor kinase,NFR1)蛋白激酶结构域的DNA片段(NFR1-PK)为诱饵,利用酵母双杂技术,筛选与NFR1相互作用的基因。结果在含X-gal的四缺选择性培养基上筛选到120个克隆。经质粒抽取、PCR鉴定、回转酵母验证得到80个阳性克隆。对26个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析,通过NCBI数据库比对分析鉴定含有JAB1、AT-RICH结构域等4个与NFR1-PK相互作用的不同基因。通过半定量RT-PCR观察在百脉根中这些基因的表达情况,其结果可为进一步研究NFR1基因的功能和调控机制提供材料。     

百脉根小GTPase激活蛋白的鉴定及突变体分离

以豆科植物百脉根为材料,利用蛋白质相互作用技术、基因表达分析和突变体表型观察研究了小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3在侧根及根瘤发育中的功能。结果表明:百脉根小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3能与ROP6~(CA)相互作用,RacGAP1和RacGAP3基因主要在根微管组织中表达,在接种根瘤菌后呈下调表达趋势。RacGAP1在侧根及根瘤原基中无表达;RacGAP3则能在侧根及根瘤基部表达。RacGAP1和RacGAP3的LORE1插入突变体表型观察显示,纯合突变体与Gifu野生型共生表型无明显差异,但RacGAP1突变体植株开花后,花朵枯萎掉落不结荚,而杂合体与野生型无差异,表明RacGAP1可能参与调控花粉发育过程,而RacGAP3在早期共生过程中可能起负调控作用。     

流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1的相互作用

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。     

HAL1基因转化百脉根(Lotus cirniculatus)的初步研究

以Bar基因为标记基因,以从酵母中克隆的耐盐基因HAL1为目的基因,构建了植物表达载体pCHAL1。以子叶为外植体,用农杆菌介导法转化豆科植物百脉根。抗性再生苗经PCR方法鉴定,HAL1基因阳性率为46.7%。初步证明HAL1基因已整合到百脉根基因组中,且转基因植株的表型正常。     

利用酵母双杂交系统筛选猪Calsarcin-1基因相互作用蛋白

 【目的】利用酵母双杂交系统研究与猪Calsarcin-1相互作用的蛋白,了解Calsarcin-1在猪骨骼肌纤维类型形成和信号通路的调控功能。【方法】首先用长白猪Calsarcin-1基因构建既无自激活性又无毒性的pGBKT7-CS1诱饵载体;然后从猪的骨骼肌组织样中提取mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA;最后通过酵母双杂交系统的共转化法筛选与Calsarcin-1相互作用的蛋白,在GenBank中比对分析相互作用基因,分析Calsarcin-1在骨骼肌中的功能。【结果】构建了pGBKT7-CS1诱饵载体,获得具有完整3′端的猪骨骼肌单链cDNA,并合成双链cDNA。筛选出4个与Calsarcin-1相互作用的蛋白,经与人的基因比较分析,发现Calsarcin-1与α-1肌动蛋白和α-3辅肌动蛋白互作,与骨骼肌Z线附近结构形成有关;与肌集钙蛋白-1和肌钙蛋白T3互作,影响钙离子的调控。【结论】分析所筛选出的蛋白功能,推测Calsarcin-1通过结合这些蛋白,维持细胞结构的稳定,影响相关蛋白的钙离子结合能力,从而参与钙离子调控;而钙离子浓度的变化将影响到其它控制肌纤维分化的因子,或其它调控通路,共同调节快慢肌纤维的形成与转化。     

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

轮状病毒NSP1和NSP3蛋白真核表达载体构建、表达及其调控Ⅰ型干扰素信号通路的功能

[目的]旨在构建轮状病毒(Rotavirus,RV)非结构蛋白1(NSP1)和3(NSP3)真核表达载体,并在人胚肾上皮HEK239T细胞中表达,随后研究轮状病毒NSP1和NSP3在体外初步影响IFN-β/ISRE报告基因活性.[方法]首先合成猿轮状病毒SA11株NSP1、NSP3编码基因连接到克隆载体pUCm-T上,...     

百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1的表达及活性鉴定

为研究LHK1蛋白的功能,构建了pPub-LHK1∶AG-GFP和pFastBac-LHK1表达载体,分别在烟草叶肉细胞和昆虫细胞表达百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1跨膜蛋白。结果表明:在烟草和昆虫细胞中LHK1蛋白都能表达,且表达的蛋白在体外都能磷酸化底物(组氨酸转移酶HP1蛋白),具有组氨酸蛋白激酶活性。     

百脉根细胞分裂素合成酶基因LjIPT2的克隆及其植物表达载体的构建

细胞分裂素在植物生长发育的许多方面行使重要功能,异戊二烯转移酶(IPT)是细胞分裂素合成的关键酶。利用生物信息学和RACE、TAIL技术从豆科模式植物百脉根中克隆到一个IPT基因,命名为LjIPT2。该基因全长为1 240 bp,含1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸。该序列已提交GenBank,登录号为DQ436463。LjIPT2基因的结构与拟南芥大部分细胞分裂素合成基因结构类似,其编码的蛋白与已鉴定出的IPT蛋白同源性较高。将LjIPT2插入到含有CaMV35S启动子的载体pCAMBIA1301上,构建了该基因的植物超表达载体35S:LjIPT2。该载体的构建为下一步研究百脉根LjIPT2基因的功能、探讨植物细胞分裂素的生物合成及其对植物生长发育的调控提供实验基础。     

百脉根小GTPase ROPs 基因反转座子插入突变体的分离和鉴定

为研究ROP(Rho-related GTPase of plants,ROP)在豆科植物共生固氮过程中的功能和作用机制,从百脉根逆转录转座子LORE1插入突变体库(http://www.kazusa.or.jp/lotus)中搜索到6个ROP相关基因突变体,通过分离和鉴定,得到不同突变体的M1代和M2代纯合体种子,对M2代进行表型鉴定及统计分析。结果表明:在早期共生表型的鉴定中,突变体与野生型植株相比,rop-like1植株的根瘤原基数明显下降,rop-like4植株的侵入线数和侵入线密度也明显下降;但仅rop-like1植株在接种14d后的结瘤数明显减少。     

百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。     

百脉根总RNA提取方法的优化

[目的]为百脉根的分子生物学研究提供基础资料。[方法]以百脉根叶片为材料,比较异硫氰酸胍法、SDS-LiCl法及SDS-LiCl改进法提取总RNA的效果并探讨活性炭、抗坏血酸对RNA提取质量的影响。[结果]异硫氰酸胍法所提取的百脉根总RNA降解严重,盐类去除不充分,该方法不适合百脉根总RNA的提取;SDS-LiCl法提取的总RNA有一定程度降解,加入液体抗坏血酸会降低百脉根RNA的提取质量;SDS-LiCl改进法提取的总RNA较为完整,有较高的纯度,在研磨过程中加入固体抗坏血酸能够提高百脉根总RNA的提取质量。活性炭对百脉根总RNA的提取无影响。[结论]研磨时加入固体抗坏血酸的SDS-LiCl改进法能提取出高质量的百脉根总RNA。     

百脉根4个共生基因在水稻中的共表达及其对水稻转录组的影响

为建立水稻-根瘤菌共生固氮体系,将百脉根共生信号转导途径中的4个功能基因(LHK1、NSP1、NSP2和NIN)转入水稻,获得稳定转化的转基因水稻,并初步检测转基因水稻的表型和转录组水平上的差异。根瘤菌感染试验结果显示,根瘤菌侵染对照(转入空载体)和转基因水稻的根毛和表皮的比率没有显著变化,但接种根瘤菌14d后,对照与转基因水稻的侧根原基数有显著差异,转共生基因水稻的侧根原基明显增多。利用水稻cDNA芯片,检测转基因水稻组与对照组在接种根瘤菌7d和不接种根瘤菌条件下根的转录组变化,结果显示,转基因组与对照组水稻在植物防御反应、激素信号转导途径相关基因均有差异性表达,表明豆科共生基因影响了水稻对根瘤菌的反应。