蚊母树叶瘿蚜分子鉴定及种群遗传分化研究

为了明确我国蚊母树叶片虫瘿致瘿蚜虫的种类及其种群遗传分化情况，从湖南、重庆、江苏、浙江4地区的蚊母树叶瘿蚜标本中提取DNA进行线粒体COI、COII基因片段序列分析，结合GenBank同源序列进行了分子鉴定，并构建了基于COI、COII基因序列的蚜虫分子系统进化树。结果表明：南京中山植物园蚊母树叶瘿蚜基因片段序列与湖南省长沙、娄底、永州种群的完全相同，即共享1个单倍型；重庆、杭州地理种群存在一定的遗传分化，但仍以长沙、南京标本的单倍型为主，且各单倍型样本之间的遗传距离非常小。序列分析结果支持4地区6个城市的蚊母树叶瘿蚜均为蚊母新胸蚜（Neothoracaphis yanonis Matsumura），杭州新胸蚜（N. hangzhouensis）是蚊母新胸蚜的同物异名。     

香蕉枯萎镰刀菌的核糖体DNA-ITS区段序列分析

寻找香蕉枯萎镰刀菌1号生理小种(Focr1)和4号生理小种(Focr 4)在rDNA-ITS区段序列上的差异,为香蕉枯萎镰刀菌小种的快速检测提供依据。对来自海南省和广东省的3个Focr 1和5个Focr 4菌株进行rDNA-ITS测序,并与GenBank中的4个尖孢镰刀菌的rD-NA-ITS序列进行比对分析。8个菌株中ITS1和ITS2分别为147和152 bp,与GenBank中的尖孢镰刀菌有97.0%~99.0%的同源性。香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种和1号生理小种与GenBank中尖镰孢菌菊花专化型、尖孢镰刀菌黄瓜专化型和一品冠萎凋病菌在rDNA-ITS序列的367与386 bp位点存在两处共性差异:4号生理小种的碱基均为T(胸腺嘧啶),而1号生理小种和GenBank中3个菌株的碱基均为C(胞嘧啶)。尖孢镰刀菌rDNA-ITS区段序列不适于区分种内不同专化型及生理小种。     

4个不同地理种群中华鳖POMC基因全长cDNA克隆及其序列分析

为探讨中华鳖不同地理种群的POMC基因的多态性,建立区分中华鳖不同地理种群的分子遗传标记,采用RT-PCR的方法扩增得到4个不同地理种群(太湖鳖种群、沙鳖种群、台湾鳖种群和黄河鳖种群)中华鳖的POMC基因,对该基因进行克隆及序列测定,并对所测序列进行比较,分析其SNP位点,并对所得的SNP位点进行验证。结果显示:4个不同地理种群中华鳖所扩增的POMC基因的核苷酸序列均为786bp;以megalign软件比较分析4个不同地理种群中华鳖的POMC基因,发现该序列中共有15个多态性核苷酸位点,经过验证,第129位核苷酸的变异为台湾鳖种群不同于其他种群的变异,第441位核苷酸变异为太湖鳖种群不同于其他种群的变异,第168和396位核苷酸为黄河鳖种群不同于其他种群的变异,第531和618位核苷酸为沙鳖种群不同于其他种群的变异。结果表明,中华鳖的POMC基因存在多态性,不同地理种群中华鳖POMC基因均有各自特异的核苷酸序列,可以作为区分中华鳖的不同地理种群的分子遗传标记。     

马铃薯抗逆基因Fe-SOD的克隆与序列分析

文章以马铃薯克新19号为材料,提取植株叶片总DNA,利用同源序列法,根据GenBank中已登陆番茄的Fe-SODmRNA序列,设计1对引物,经PCR扩增获得了大小为1413bp的片段。序列分析表明,预测其含有4个外显子和3个内含子,编码了145个氨基酸序列,分子质量为16.255ku,等电点为5.88。其编码的氨基酸序列包含了两个Fe-SOD蛋白的保守结构域,与NCBI数据库中其他植物的Fe-SOD蛋白同源性很高,与番茄中58～203相关片段同源性高达93.79%。该基因已在GenBank上注册,登录号为EU545469。     

寄生柑橘和杉木的柑橘半穿刺线虫种内群体变异

[目的]对寄生于柑橘与杉木2种寄主的柑橘半穿刺线虫种群的rDNA-ITS区(ITS1-5.8S-ITS2)及形态变异进行研究,分析种群间遗传多态性及其亲缘关系.[方法]对采自中国3个省份(福建、四川、贵州)柑橘产区的21个柑橘半穿刺线虫种群(柑橘种群)及福建省杉木林区的6个柑橘半穿刺线虫种群(杉木种群)的ITS区进行PCR扩增、克隆与测序,通过相关软件进行序列比对与系统发育分析;对3个柑橘种群及1个杉木种群进行形态特征测计分析.[结果]柑橘半穿刺线虫的柑橘种群与杉木种群相比,ITSI序列相似性为93.2%-99.3%,ITS2序列相似性为92.4%-100%;基于ITS序列构建的系统发育树,所有杉木种群与福建省部分柑橘种群处于同一进化主分枝.4个柑橘半穿刺线虫种群间部分测量值存在显著差异,补充描述了种群内二龄幼虫尾部形态变异类型.[结论]柑橘半穿刺线虫柑橘种群和杉木种群在rDNA-ITS序列相似性高,序列差异不能用于种群的区分;杉木种群与福建部分柑橘种群在进化上可能有相同的地理起源.种群间部分测量值的显著差异及二龄幼虫尾部变异应属于种群正常变异.     

苹果茎痘病毒种群遗传多样性分析

苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)是一种严重危害果树生产的潜隐性病毒。基于前期研究所获得的6 个ASPV 中国分离物CP基因的核苷酸序列,结合GenBank 中报道的序列,对ASPV 种群遗传多样性特点进行分析。应用MEGA 4.0 软件分析了不同地理来源、不同寄主来源组内和组间的各分离物CP基因的遗传多样性,表明ASPV 种群遗传变异与寄主来源、地理分布不存在明显的相关性。CP编码区仍处于净化选择中,亚洲的分离物、梨分离物承受着较高的选择压力。DnaSP 软件分析显示,ASPV 经历了明显的种群扩张,并有继续扩展蔓延之势。因而有必要进一步加强病毒检测及种苗脱毒,严格控制带毒种苗传播。     

昆虫病原线虫Oscheius myriophila 的形态和分子特征

2010—2013年在昆虫病原线虫调查中,从华南农业大学植物园采集土样,利用大蜡螟(Galleria mellonella)诱集,获得1个小杆类昆虫病原线虫种群(华农种群HN)。该线虫雌虫的形态符合Oscheius myriophila的原始描述,测量值中除虫体宽度(70~123 vs 57~70 μm)和口腔宽度(5~8 vs 4.5 μm)更宽、尾更长(138~188 vs 108~135 μm)外,其余特征值均在该种原始描述的范围内;用HN种群的18S和28S r DNA序列进行Blast搜寻和比对,结果表明该种群18S序列与GenBank中的O.myriophila(AY602176)的相似度高达99%(1512/1514=99%),28S序列与O.myriophila(U81588)的相似度达100%(609/609=100%)。分子系统发育分析结果显示,HN与Gen Bank中的多个O.myriophila种群以高置信度聚在相同的Insectivorus 支系。综合形态学和18S和28S rDNA序列特征,确定华农种群HN为Oscheius myriophila。     

绵羊Nanog基因部分编码序列的克隆及分析

利用NCBI中GenBank里查询到已登录的人、猪、牛和山羊的NanogmRNA序列,通过多重同源比较,获得高度保守区域序列,设计了同源引物,并首次对绵羊Nanog部分编码序列进行了分子克隆。经过PCR扩增,获得绵羊Nanog基因第二外显子168 bp(GenBank Accession:EF436277)、第四外显子124 bp(GenBank Acces-sion:EF596905)和第二外显子至第四外显子498 bp(GenBank Accession:EU016097)三个序列片段。经测序,三个序列已登录GenBank。绵羊Nanog第二显子168 bp与山羊相应序列相似性最高达97%,与人相应序列相似性最低达84%;绵羊Nanog第四显子124 bp与山羊相应序列相似性最高达100%,与人相应氨基酸序列相似性最低达73%;经判断,绵羊Nanog第二外显子至第四外显子498 bp序列片段应该是一段假基因序列,与山羊mRNA相应序列相似性最高达98%,与人mRNA相应序列相似性最低达83%。本研究为进一步研究绵羊Nanog基因表达谱提供了序列信息。     

紫芝栽培新品种武芝 2 号基于 rDNA-ITS和 ITS2 的分子鉴定与分析

【目的】探讨利用 rDNA-ITS 及其 ITS2 二级结构进行紫芝栽培新品种武芝 2 号（原名紫芝 S2） 的分子鉴定。【方法】通过第一代和第三代测序技术分别获得武芝 2 号的 ITS 序列，针对灵芝属（Ganoderma spp.）相关种类的 ITS 序列构建系统进化树进行分子分类鉴定，采用 rDNA-ITS 及相关引物序列进行 BLAST 比对 分析，在线预测 ITS2 二级结构。【结果】Sanger 法测序得到的武芝 2 号 ITS 序列（MG282563.1，649 bp），与 GenBank 中 5 个紫芝 ITS 序列具有高相似度（99.53%~100%），并且与已知 4 个紫芝菌株或实物标本在灵芝属系 统进化树上聚为一个分支，同属一个种群。已知 2 个紫芝特异性引物短序列（GS1_22bp、GS2_22bp）出现在武 芝 2 号 ITS 序列的 119~140 bp 正向和 588~567 bp 反向位置；在武芝 2 号基因组 Scaffold No.49 上 rDNA 中找到 4 个串联重复的 ITS 区域，与 Sanger 法测序得到的单个 ITS 序列高度一致；在 ITS2 序列二级结构上，武芝 2 号与 ITS2 数据库中紫芝 Ganoderma sinense 的 3 个螺旋区结构相同，仅螺旋 IV 区间夹角不同。【结论】基于 ITS 和 ITS2 分子鉴定，确认了武芝 2 号与已知紫芝 G. sinense 同属一个种群，在 ITS2 二级结构螺旋 IV 区存在夹角差异； 此外，验证了 2 个已知紫芝特异性扩增引物的有效性。     

基于mtDNA控制区部分序列探讨东北狍与西伯利亚狍、欧洲狍的遗传分化

对来自中国东北12个狍样本线粒体控制区序列进行了测定,初步探讨了东北狍种群的遗传结构及其与西伯利亚狍、欧洲狍的遗传分化问题.结果在562 bp的线粒体DNA控制区序列中共发现40个变异位点,其中转换38个,颠换2个(Ti/Tv=19:1),多态位点的比例为7.12%.共检测到12种线粒体DNA单倍型,单倍型间的序列差异平均为2.00%.结合GenBank上西伯利亚狍和欧洲狍同源序列进行分析,确定27个单倍型,种群内及种群问无共享单倍型.AMOVA分析结果表明,遗传变异主要发生在种群间(67.28%).东北狍与西伯利亚狍无明显遗传分化(Fst:0.112 25,P>0.05),二种群间基因流程度最大(2.03).而东北狍与欧洲狍(Fst=0.718 28,P<0.001)、西伯利亚狍与欧洲狍(Fst=0.791 84,P<0.001)、西伯利亚狍-东北狍组合与欧洲狍(Fst=0.694 50,P<0.001)均具有显著的遗传分化.系统发生树和单倍型网络关系图均将27个单倍型分成2个进化枝:欧洲狍进化枝和西伯利亚狍-东北狍进化枝.     

香蕉穿孔线虫观赏植物种群对香蕉的致病性研究

 【目的】为了明确香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）观赏植物种群对香蕉（Musa spp.）的致病性。【方法】通过室内盆栽接种测试的方法,研究侵入中国的6个香蕉穿孔线虫观赏植物种群对大蕉、粉蕉、皇帝蕉和巴西蕉的幼苗的致病性。【结果】供试的6个香蕉穿孔线虫观赏植物种群都能明显侵染大蕉、粉蕉和皇帝蕉,并显著抑制大蕉、粉蕉和皇帝蕉的生长;只有2个种群对巴西蕉表现为弱致病,对其生长有一定的抑制。【结论】侵入中国的6个香蕉穿孔线虫观赏植物种群普遍对大蕉、粉蕉和皇帝蕉有明显的致病性,少数种群对巴西蕉有一定的致病作用。     

香蕉穿孔线虫对烟草和芒果的寄生性和致病性

 【目的】利用从进口观赏植物上截获，并培养保存在胡萝卜愈伤组织上的香蕉穿孔线虫10个种群，研究香蕉穿孔线虫对烟草和芒果的寄生和致病性。【方法】采用温室盆栽接种方法，进行寄生和致病性测定。【结果】香蕉穿孔线虫在烟草和芒果根际的繁殖率Rf＞1，接种香蕉穿孔线虫的烟草和芒果植株生长缓慢、矮小，根系衰弱、变色腐烂，有明显受害症状。【结论】烟草和芒果是香蕉穿孔线虫新的适合寄主植物，香蕉穿孔线虫对这2种植物具有明显的致病性，不同种群的致病力有差异。     

Parasitism and pathogenicity of Radopholus similis to Ipomoea aquatica,Basella rubra and Cucurbita moschata and genetic diversity of different populations

Ten populations of Radopholus similis from different ornamental hosts were tested for their parasitism and pathogenicity to water spinach(Ipomoea aquatic), malabar spinach(Basella rubra), and squash(Cucurbita moschata) in pots. The results showed all three plants were new hosts of R. similis. Growth parameters of plants inoculated with nematodes were significantly lower than those of healthy control plants. All R. similis populations were pathogenic to the three plants, but pathogenicity differed among populations from different hosts. The same R. similis populations also showed different pathogenic effects in the three different plants. Rad N5 population from Anthurium andraeanum had the highest pathogenicity to the three studied plants. Rad N1 from A. andraeanum had the lowest pathogenicity to squash and Rad N7 from Chrysalidocarpus lutesens had the lowest pathogenicity to water spinach and malabar spinach. R. similis is usually associated with root tissues, but here we report that it could be found to move and feed in the stem bases of all three studied plants. Sequence and phylogenetic analyses of DNA markers of the 18 S r RNA, 28 S r RNA, ITS r RNA, and mitochondrial DNA gene sequences of ten R. similis populations revealed significant genetic diversity. Rad N5 and Rad N6 populations from anthurium showed a close genetic relationship and could be distinguished from other populations by PCR-RFLP. At the same time, Rad N5 and Rad N6 populations were the most pathogenic to three studied plants. These results confirm the e xistence of large biological variability and molecular diversity among R. similis populations from the same or different hosts, and these characteristics are related to pathogenic variability.     

从混合线虫样品和植物组织中直接检测香蕉穿孔线虫的ITS-PCR方法

 【目的】建立直接从多种线虫混合样品以及香蕉和红掌根组织中检测鉴定香蕉穿孔线虫的PCR方法。【方法】使用Primer Premier 5.0在香蕉穿孔线虫的ITS区设计1对特异性引物，运用PCR技术对目的线虫DNA进行特异性检测。【结果】通过对17种24个种群线虫的检测表明，所设计的引物只能从香蕉穿孔线虫种群中特异扩增出rDNA-ITS片段，产物大小为518 bp。利用该特异引物以及建立的DNA提取方法和PCR体系，可以直接从香蕉穿孔线虫与短体线虫、螺旋线虫、肾状线虫、根结线虫、茎线虫、矮化线虫、纽带线虫、丝尾垫刃线虫、滑刃线虫和小杆线虫混合样品中特异扩增出目的线虫的rDNA-ITS片段，并可以分别从混合有不少于3条香蕉穿孔线虫的2 cm香蕉或红掌根组织（约0.1 g）中特异检测出目的线虫的DNA片段。【结论】本研究设计的特异性引物以及建立的DNA提取方法和PCR体系可直接从多种线虫混合的样品以及香蕉和红掌根组织中快速检测鉴定出香蕉穿孔线虫。     

香蕉穿孔线虫土壤存活力的测定

温室内对香蕉穿孔线虫在无植物及其组织土壤中的存活能力进行了观察和测定.结果表明:在8～38℃环境下的潮湿土壤中(湿度为50%～100%),所有供试7个种群至少能存活5个月,多数种群可存活6～9个月,个别种群可存活11个月;种群间在同一种土壤中的存活力有差异,同一种群在基质土和蕉园土中的存活力差异不显著;在存活虫态方面,多数种群雌虫最多、存活时间最长,雄虫次之,幼虫则很少,但也有少数种群的雄虫存活力强于雌虫;在8～38℃环境下的干燥土壤中(湿度为6%～10%),供试的9个种群存活时间不超过20 d;各种群在干燥基质土的存活能力强于干燥蕉园土,存活的虫态多数是雌虫,雄虫很少,未见幼虫.     

基于rDNA-ITS的中国外来香蕉穿孔线虫种群的系统发育分析

为揭示传入中国的香蕉穿孔线虫群体间的遗传差异,分析其亲缘和进化关系,明确中国香蕉穿孔线虫的来源和传入途径,分别扩增了多雌繁殖群体和相应种群的单雌繁殖群体后代rDNA-ITS,对扩增产物进行测序,通过序列比对分析其遗传变异,并构建系统发育树研究其亲缘和进化关系。结果表明:供试香蕉穿孔线虫20个种群的rDNA-ITS序列大小为705~713bp,序列同源性比较高,相似性在95%以上,序列变异率为0~7.5%;各群体ITS1和ITS2序列大小分别为273~276bp和151~152bp,各种群间的序列相似性分别达到98.58%和98.35%以上;单雌繁殖群体与相应的多雌繁殖群体的序列相似性非常高,有8个种群的2个繁殖群体序列相似性达到100%,其他种群的2个繁殖群体序列相似性达97%以上;基于ITS序列构建穿孔属线虫的系统发育树说明,所有香蕉穿孔线虫聚在一个大枝,分成4小分枝,其中寄主为红掌的RsW种群单独聚为一枝,遗传距离较远,寄主为绿宝石的RsH遗传距离相对其他种群也较远,寄主分别为天鹅绒竹芋和孔雀竹芋的RsP和RsS种群的遗传距离则相对较近,这说明传入中国的香蕉穿孔线虫种群可能直接来源是欧洲的竹芋科和天南星科观赏植物,而前者的最初来源可能是苏丹的香蕉,后者的最初地理来源较复杂。     

香蕉穿孔线虫28S rRNA基因的D2/D3区序列分析

采用线虫通用引物D2A和D3B对9个香蕉穿孔线虫种群的核糖体DNA 28S大亚基的D2/D3区进行了扩增,获得的片段长度约为780 bp,克隆测序后使用UPGMA法进行聚类分析和构建系统发育树.结果表明9个线虫种群D2/D3区核苷酸序列相似性为99.13%,其中8个群体的序列与越南报道的香蕉穿孔线虫近源种(Radopholus sp.7B VietNam)的D2/D3区核苷酸序列(DQ328712)相似性为97.46%,说明香蕉穿孔线虫D2/D3区具有较大的保守性.聚类分析结果表明,RSHN12r、RSSH、RSHL、RSHK、RSLZ、RSSZ、RSHN13、RSHN12p等8个种群聚为一类,亲缘关系很近,RSHN3群体与以上8个群体亲缘关系较远,说明RSHN12r、RSSH、RSHL、RSHK、RSLZ、RSSZ、RSHN13、RSHN12p这8个香蕉穿孔线虫种群可能来源于同一地理种群,而RSHN3种群可能来源于另一个地理种群.     

Cathepsin B基因的沉默对香蕉穿孔线虫繁殖力的影响

【目的】通过研究cathepsin B基因对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)繁殖力的影响,探索cathepsin B基因的功能,为利用该基因防治香蕉穿孔线虫和植物寄生线虫组织蛋白酶的进一步研究提供科学依据。【方法】根据已知香蕉穿孔线虫cathepsin B基因(Rs-cb-1)的序列,从香蕉穿孔线虫克隆cathepsin B基因,以含有目的基因的质粒DNA为模板合成特异的双链RNA(dsRNA),采用dsRNA浸泡的方法对香蕉穿孔线虫进行RNA干扰(RNAi)试验,通过室内接种胡萝卜愈伤组织繁殖线虫的方法,研究cathepsin B基因的沉默效应对香蕉穿孔线虫繁殖力的影响。【结果】用Rs-cb-1dsRNA浸泡12、24、48、72h后香蕉穿孔线虫的平均繁殖倍数分别为165、93、54、53,而未经dsRNA处理的该线虫繁殖倍数均大于420;并且Rs-cb-1dsRNA浸泡的时间不同,对应各处理之间的繁殖倍数差异显著。RT-PCR检测,经Rs-cb-1dsRNA浸泡12h后,目的基因在香蕉穿孔线虫的表达量明显减弱,浸泡24h后其表达量进一步减弱,但还有微量表达,经dsRNA浸泡48、72h后目的基因基本不表达。【结论】Rs-cb-1与香蕉穿孔线虫的繁殖力相关;Rs-cb-1dsRNA的浸泡可以明显抑制cathepsin B基因的表达量,从而影响香蕉穿孔线虫的繁殖力,但浸泡时间不同Rs-cb-1的沉默效率也不同,沉默效率最好的干涉时间是48h。     

南方小花蝽对切花月季西花蓟马的控制作用

南方小花蝽是多种小型昆虫的重要天敌。在切花月季大棚中以2头/m2和4头/m2 2种密度释放南方小花蝽,研究其对切花月季上西花蓟马的防控效果。结果表明,无论是对西花蓟马的若虫还是成虫,高密度释放(4头/m2)的控制效果好于低密度释放(2头/m2),并且防治效果随着释放时间的延长而增加,但最高防效不到60%。对于商品价值很高的花卉而言,释放南方小花蝽可能起不到保护花卉品质的效果。     

相似穿孔线虫在中国的适生区预测

 【目的】相似穿孔线虫（Radopholus similis）是中国一类检疫对象，随着国际贸易日益加剧，该线虫传入中国的风险也日益加大，急需对其适生性进行分析。【方法】利用已广泛用于物种潜在分布预测的GARP与MAXENT两种生态位模型预测相似穿孔线虫在中国的适生区，并对预测结果进行了阈值依赖和非阈值依赖比较。【结果】两个模型均能较好地预测相似穿孔线虫的潜在地理分布；预测在中国适生区主要分布在南方各省，包括海南、广东、福建、云南、台湾等省区；经检验MAXENT预测结果较GARP好。【结论】相似穿孔线虫可随花卉苗木的国际运输传入中国，并可在中国南方沿海地区及花卉进出口大省云南省等地区发生；上述地区的进出口口岸应加强对相似穿孔线虫的检疫工作。