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相似文献
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1.
[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段(shEGFP)对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1(或CACCC盒)及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82%和87.45%;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组(P<0.05),而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著(P>0.05).[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.  相似文献   

2.
水牛 STAT5a 和 STAT5b 基因启动子克隆及其活性分析   总被引:1,自引:1,他引:0       下载免费PDF全文
为了解转录激活与信号转导因子5(STAT5)在水牛乳腺发育及泌乳生理中的功能,对水牛STAT5a和STAT5b基因的5′调控区启动子序列进行了克隆,并比较其活性.根据GenBank已公布的牛STAT5a和STAT5b基因序列设计特异性引物,以广西本地水牛乳腺组织基因组DNA为模板,通过PCR法分别扩增不同长度STAT5a和STAT5b基因启动子片段并进行生物信息学分析.结果表明:克隆得到的水牛STAT5a基因启动子片段(P1和P2)大小是500bp,700bp,STAT5b基因启动子片段(P3,P4和P5)大小是500bp,800bp,1 500bp.在线分析结果显示,仅P2片段中存在高甲基化位点,且富含SP1,AP2等转录因子结合位点.将构建的不同长度启动子片段分别连入pGL3-Basic载体,分别转染水牛乳腺上皮细胞,检测荧光素酶表达水平.与未转染组相比,P1~P5质粒转染组的荧光素酶比值均显著提高(p0.05);添加5mg/mL质量浓度催乳素(PRL)处理乳腺上皮细胞,P3质粒转染组的荧光素酶比值显著高于其他各组(p0.05).以上结果表明,水牛STAT5a和STAT5b基因启动子活性均受到PRL调节,两者表达水平在水牛乳腺上皮细胞中不同,且STAT5b基因表达受PRL调控更为明显.  相似文献   

3.
【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达。【结果】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,该载体可在bMEC中特异性地表达绿色荧光蛋白;半定量RT-PCR检测发现,转染pBLG-EGFP-TAP可显著提高家兔乳腺组织中TAPmRNA的表达水平。【结论】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,为进一步研究奶牛TAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供了重要材料。  相似文献   

4.
为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。  相似文献   

5.
 【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。  相似文献   

6.
人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor Ⅸ,hFIX)是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor Ⅸ,hFIX)cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH) polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白(CSN2)启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。  相似文献   

7.
[目的]寻找并克隆有活性的高尔基体膜蛋白GP73的启动子。[方法]对GP73基因转录起始位点上游1 000 bp至下游400 bp序列进行软件分析预测,以肝癌细胞系Huh7基因组DNA为模板,扩增目标片段,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组质粒,转染细胞后在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并采用流式细胞仪定量检测转染细胞的荧光强度。[结果]发现GP73转录起始位点上游980到下游330 bp长1 310 bp的序列具有启动子功能。该区域可能具有两个核心启动子序列和多个保守序列,包括TATA box和NF-κB、AP1、GC-SP1等DNA结合序列。[结论]该研究为探讨GP73的转录机制提供了参考。  相似文献   

8.
【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(NM_001002885)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。  相似文献   

9.
为研究人CD46(hCD46)基因启动子的启动特性,研制具有hCD46组织特异性表达特征的转基因小鼠,设计扩增hCD46基因启动子的PCR引物,用HeLa细胞基因组DNA为模板扩增hCD46基因启动子DNA片段,测序结果表明:其序列与GenBank中hCD46完整基因5′端某片段的同源性高达99.9%。用此DNA片段替换表达载体pcD-NA3EGFP中的CMV启动子,且在该片段与EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因的第2内含子RGI。重构的表达载体在2种鼠源细胞CHO和SP2/0中均可启动EGFP表达,表达量与人体内同源组织中hCD46的相似,说明该研究克隆了结构和功能正确的hCD46基因启动子。  相似文献   

10.
人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究   总被引:5,自引:0,他引:5  
构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。  相似文献   

11.
高尔基体驻膜糖蛋白GP73启动子克隆(英文)   总被引:2,自引:0,他引:2  
  相似文献   

12.
[目的]构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。[方法]将劳氏肉瘤病毒增强子/启动子、复制缺陷型艾滋病病毒(HIV-1)的5’端长重复序列(LTR)、HIV-1ψ卫包装信号、HIVRev反应元件、山羊B-casein调控序列、pro—UKM13、△U3/3’LTR依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体;通过体外转染人乳腺癌细胞系(MCF-7)、仓鼠卵巢细胞(CHO)和泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。[结果]构建的山羊乳腺特异性表达载体酶切鉴定是正确的;利用该载体转染细胞,采用溶圈法和Westernblot检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。[结论]为在转基因动物的乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。  相似文献   

13.
靶向Annexin A3短发夹环RNA干扰载体的构建及鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
[目的]利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术构建和鉴定膜联蛋白A3(Annexin A3)的真核表达载体,为进一步研究Annexin A3在肝细胞中的功能奠定基础。[方法]人工合成3对shRNA序列,退火后定向克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo上,采用酶切和测序法鉴定。[结果]质粒酶切及测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。[结论]成功构建膜联蛋白A3靶向的真核表达载体。  相似文献   

14.
[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20~22 h后随机分为2组:①在体外受精7~10 h或18~20 h后向卵胞质内注入约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②分别注入单个精子与约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显著(P0.05),且IVF 7~10 h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18~20 h(P0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7~10 h注射的效果优于IVF后18~20 h注射。  相似文献   

15.
通过对pBC1中的乳腺特异表达启动子成分进行分析,鉴定了位于β酪蛋白启动子上游两个EcoRⅠ位点(-89~-94和-120~-125)之间的缺失片段,31bp的缺失使得该载体中的一个乳控盒元件(-112~-141)和一个乳腺因子识别序列(-92~-102)遭到破坏,并使得位于TATA框上游的所有启动子成分发生了位置改变。通过与山羊β酪蛋白启动子序列进行比较,设计并合成了缺失片段,经一系列的酶切和连接处理,使得该缺失得到了修复,修复后的载体具有所有乳蛋白表达需要的启动子调控原件。本试验结果为利用修复后的乳腺特异高效表达载体进行乳腺生物反应器的研究奠定了分子生物学基础。  相似文献   

16.
[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。  相似文献   

17.
[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20~22h后随机分为2组,①在体外受精7~10或18~20h后向卵胞质内注入约7.5pL50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②则分别注入单个精子与约7.5pL50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显著(P>0.05),且IVF7~10h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18~20h(P<0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7~10h注射的效果优于IVF后18~20h注射。  相似文献   

18.
【目的】克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子,确定其活性核心区,为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础。【方法】通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测,根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段,并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值,以确定不同ANK1基因启动子片段的活性。【结果】发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点(TSS)、2个Cp G岛和多个转录因子结合位点,并以此作为ANK1基因启动子的分段依据,将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段。成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因,双荧光素酶试剂盒检测结果显示,广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强,与其他片段存在显著差异(P0.05)。【结论】成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段,且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段。  相似文献   

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