农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

利用农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化,研究了不同影响因子对玉米遗传转化效率的影响。结果表明,相比自交系H99,玉米杂交组合H99×A188更适宜作为玉米遗传转化的受体材料;继代6d后的胚性愈伤组织最适宜农杆菌转化;农杆菌菌株EHA105的侵染效果好于EHA101;抗性愈伤组织筛选培养基中除草剂筛选的临界质量浓度为4.0mg/L;头孢霉素质量浓度在500mg/L时适合进行除菌处理,且对植株再生影响较小。     

基因枪介导的玉米NPR1基因的遗传转化(英文)

[目的]探索出玉米基因枪转化的条件。[方法]以玉米自交系7239的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,研究了轰击距离、气体压力、真空度和轰击次数对转化率的影响。[结果]转化时以金粉用量100μg/枪、发射点与靶细胞距离9cm、气体压力1350psi、真空度25In·Hg、轰击次数2次的组合最佳。经潮霉素(Hygromycin)筛选,获得了再生植株,PCR分析及Southern杂交结果表明NPR1基因已整合到玉米基因组中,平均转化率为1.76%。[结论]该研究为玉米优良抗病品种的培育奠定了基础。     

基因枪介导的玉米NPR1基因的遗传转化

[目的]探索玉米基因枪转化的条件。[方法]以玉米自交系7239的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,研究了轰击距离、气体压力、真空度和轰击次数对转化率的影响。[结果]转化时以金粉用量100μg/枪、发射点与靶细胞距离9 cm、气体压力1 350 psi、真空度25In.Hg、轰击次数2次的组合最佳。经潮霉素(Hygromycin)筛选,获得了再生植株,PCR分析及Southern杂交结果表明NPR1基因已整合到玉米基因组中,平均转化率为1.76%。[结论]该研究为玉米优良抗病品种的培育奠定了基础。     

基因枪法介导的南瓜的遗传转化体系构建

用南瓜的愈伤组织作受体进行了基因枪的轰击试验,确立了以轰击压力为1 100 psi,轰击距离为9 cm,3μLDNA／mg金粉的轰击比例,优化了基因枪的轰击参数;在轰击前4 h和轰击后16 h用附加有0．4 mol／L甘露醇的MS培养基进行高渗处理、轰击后恢复培养6 d,可以增加转化成功的机率。用1 mg／LBasta作 为选择压,筛选培养45 d后进行GUS基因组织化学染色,结果表明GUS基因可在南瓜的组织中瞬时表达。     

玉米愈伤组织的耐盐性筛选

以玉米(Zea mays L.)自交系H99、丹988、丹598的胚性愈伤组织为材料,利用农杆菌介导的方法将带有p CAMBIA1301-BADH抗盐碱基因转入供试品种的胚性愈伤中,通过愈伤组织对盐(NaCl)的敏感性试验,确定愈伤组织适宜选择压,同时研究了2,4-D浓度对筛选结果的影响。结果表明,玉米自交系H99在盐筛培养基中NaCl浓度为200 mmol/L,2,4-D浓度为1.0 mg/L时筛选结果最佳。对移栽成活的48棵抗盐转p CAMBIA1301-BADH基因植株,经PCR检测有3株呈阳性,阳性株率达到6.3%,初步证明目的基因已整合到玉米基因组中。     

激素和附加物对玉米幼胚愈伤组织诱导的影响

以沈农糯玉米为试材,改良MS培养基为基本培养基,研究了不同浓度的2,4-D对玉米幼胚愈伤组织的诱导效果,筛选出最适的2,4-D浓度为4 mg/L。4 mg/L 2,4-D配合使用较低浓度的6-BA(0.5 mg/L)不仅可以提高愈伤组织的诱导率,而且胚性愈伤组织的诱导率也有所提高。培养基中同时加入700 mg/L水解酪蛋白和1 000 mg/L的L-脯氨酸可显著提高胚性愈伤组织的诱导率;甘露醇和AgNO3对胚性愈伤组织诱导率提高无明显作用,但对改善胚性愈伤组织的质量起重要作用。     

马铃薯地方主栽品种"春薯4号"遗传转化体系的建立

以吉林省马铃薯主栽品种"春薯4号"(Solanum tubberosum cv.Chunshu 4)无菌试管苗为材料,以茎段为外植体,采用L9(33)正交试验设计,研究植物激素对愈伤组织诱导和分化的影响;通过对遗传转化体系中的筛选剂浓度、抗生素种类及浓度等影响因素的优化,初步建立了马铃薯"春薯4号"的遗传转化体系.结果表明:最适合愈伤组织诱导的培养基配方为MS+2.0mg/L6苄氨基嘌呤(6-BA)+0.2 mg/L萘乙酸(NAA)+0.3 mg/L 2,4-二氯苯酚代乙酚(2,4-D),"春薯4号"茎段的愈伤组织诱导率最高,为98.57％,愈伤组织为淡绿色,呈致密的哑铃形;最适合愈伤组织分化的培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L吲哚乙酸(IAA)+1.0 mg/L玉米素(ZT),愈伤组织的分化出苗率最高,为54.1％,幼苗粗壮,畸形苗少;在遗传转化体系中,筛选剂双丙氨膦浓度为6.0 mg/L时,为愈伤组织最适筛选压,为4.5 mg/L时,为再生苗最适筛选压;农杆菌抑菌剂最适组合为500 mg/L头孢霉素+200 mg/L羧苄青霉素.     

玉米成熟胚愈伤组织诱导的初步研究

试验以H99、综31和郑58三个玉米自交系的成熟胚为外植体,利用正交试验设计L9(34),对影响愈伤组织诱导的基因型、培养基、2,4-D浓度和Ag NO3浓度4个因素进行了研究。结果表明:各因素对初级愈伤诱导率影响大小为基因型培养基2,4-D浓度Ag NO3浓度;对胚性愈伤诱导率影响大小为基因型Ag NO3浓度2,4-D浓度培养基。诱导中最优组合为综31+10 mg/L Ag NO_3+MN+2 mg/L 2,4-D,继代中最优组合为综31+10 mg/L Ag NO3+MN+1 mg/L 2,4-D,其初级愈伤诱导率为87.41%,胚性愈伤诱导率为29.74%。     

番茄雄性不育系HL-2快速繁殖的初步研究

以番茄雄性不育系HL-2的叶片、带芽茎段为外植体进行组织培养,研究了不同激素及其不同浓度组合对番茄雄性不育系愈伤组织诱导、不定芽分化的效果。结果表明,叶片较易形成愈伤组织,试验筛选出叶片进行培养时各阶段的培养基为MS 6-BA1.5mg/L~3.0mg/L IAA0.1mg/L~0.5mg/L 30g/L蔗糖均可诱导出愈伤组织,但以MS 6-BA1.5mg/L IAA0.1mg/L 30g/L蔗糖最佳;愈伤组织芽的分化以MS 6-BA2.0mg/L IAA0.1mg/L 30g/L蔗糖最佳。     

农杆菌介导遗传转化云蔗05-51

【目的】建立云蔗05-51组培再生体系明确其对抗生素G418的耐受性,为云蔗05-51基因工程遗传改良提供参考。【方法】以云蔗05-51心叶为外植体,MS基本培养基添加2, 4-D、6-BA和KT,设置质量浓度梯度及不同激素配比,诱导愈伤组织及其分化植株。在云蔗05-51胚性愈伤组织增殖与不定芽分化阶段,培养基中添加不同含量的G418,确定合适的G418筛选质量浓度。以nptⅡ为标记基因,农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织,筛选获得抗性植株,PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。【结果】云蔗05-51愈伤组织诱导与增殖阶段,适宜的培养基配方为MS基本培养基添加3.0 mg/L 2, 4-D;愈伤组织分化不定芽阶段宜采用MS基本培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。云蔗05-51对G418耐受性筛选结果显示:愈伤组织增殖阶段和分化不定芽阶段G418的适宜筛选质量浓度分别为40和20 mg/L。G418抗性植株PCR检验表明:标记基因nptⅡ已成功整合到云蔗05-51转基因植株基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明:nptⅡ的蛋白水平得以表达。【结论】建立了云蔗05-51心叶组培再生体系,明确了40和20 mg/L G418是筛选抗性愈伤和抗性植株的适宜质量浓度。建立了农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织系统,为有益基因导入甘蔗品种提供了参考。     

番红花组织基因枪转化瞬时表达检测

用高压氦气式基因枪将CaMV35S启动子驱动下的gus基因导入经济植物番红花的叶鞘和叶、芽来源的愈伤组织块中 ,4 8h后染色检测到了gus基因的瞬间表达 ,2 0d后仍检测到极少量表达 .研究发现 ,轰击前在加有 0 5mol L甘露醇的液体愈伤组织继代培养基上处理 6h ,明显增加了gus基因表达的数量 ;选择 110 0psi× 9cm的轰击条件 ,转化效果最好 ;高浓度卡那霉素 (5 0 0～ 80 0mg L)可以作为筛选剂 .结果表明 ,基因枪法是有效的番红花遗传转化方法 ,gus基因可以作为番红花基因工程研究的报告基因 ,CaMV35S启动子能有效驱动外源基因在番红花组织中表达     

苜蓿转LEA_3基因研究

以苜蓿(Medicago sativa)品种中苜一号为试材,进行愈伤组织的诱导。通过基因枪法将来源于大麦的胚胎发生丰富蛋白基因lea3导入愈伤组织细胞,于8 mg/L PPT的选择压力下筛选2个月,获得了抗性愈伤组织及再生植株,并将再生植株再次转入含有PPT的诱导继代培养基中进行筛选。通过PCR检测,在21株再生植株中有2株扩增出了目的基因片段。证实lea3基因已导入了苜蓿细胞中,并表达。     

玉米自交系幼胚培养与基因枪转化研究

玉米自交系幼胚在添加 1～ 2mg/L 2 ,4-D的N6培养基上能够诱导形成不同类型的胚性愈伤组织。愈伤组织的诱导率与基因型和 2 ,4-D浓度有关 ,6个自交系的诱导率在 5 2 %～ 89%。将淡黄色颗粒状结构致密型愈伤组织在N6诱导培养基上继代培养 2 0个月 ,仍具有较强的分化能力。在附加 2mg/L 6 -BA和0 .2mg/LNAA的N6分化培养基上 ,有 2 7%～ 41%的愈伤组织分化成苗。通过基因枪轰击成功地将 pbarGUS基因转入玉米细胞 ,获得了大量的转化胚性愈伤组织。用 0 .4mol/L的甘露醇高渗处理幼胚 ,能显著提高pbarGUS基因在细胞中的表达 ,高渗处理转化率较对照提高了 3倍     

抗除草剂转基因玉米研究

本研究选用了6种培养基配方对6种不同的玉米(Zea mays L.)基因型材料进行了组织培养实验,筛选出YD这一优良基本培养基配方,再用这一基本培养基对23份玉米材料进行组织培养分析,从中选出了18-599红等9份优良玉米材料。最后用18-599红作为受体,通过基因枪法导入了外源bar基因,转化后的愈伤组织经过在含bialaphos浓度(PPT)为6、10、15mg/L的选择培养基中筛选3轮后,得到长大成活植株75株,结实收获植株8株。PCR鉴定结果表明,bar基因已整合到玉米基因组中。     

胡萝卜遗传转化体系的建立

以新黑田五寸胡萝卜下胚轴为外植体,研究对胡萝卜抗性植株的影响因素及目的基因的整合情况,建立了较为完善的转化体系。实验结果表明:以胡萝卜下胚轴为材料,用苗龄7d,共培养2d,浸染15min的体系,Kan抗性芽的分化频率可达52%。获得抗性愈伤培养基:B5+0.1mg/L2,4-D+0.2mg/LKT+75mg/LKan+500mg/LCef,抗性芽诱导培养基:B5+100mg/LKan+500mg/LCef;抗性植株生根培养基:B5+0.1mg/LIBA+75mg/LKan+300mg/L:Cef;对转基因植株进行了PCR分子学检测,初步证明外源基因已整合到胡萝卜基因组中。     

基因枪法介导的魔芋遗传转化研究

利用基因枪轰击法建立了魔芋的遗传转化体系。试验结果表明，氦气压力／轰击距离以7．58 GPa／9cm最适。在轰击前4 h和轰击后16 h用附加有0．4 mol／L甘露醇的MS培养基进行高渗处理、轰击后恢复培养6～7 d，有利于减少逆境伤害，增加转化成功的几率。早期选用1 mg／L Basta作为选择压，而后期的筛选使用2 mg／L较高浓度的Basta可以获得真正的转化子。对获得的91株抗性植株进行了PCR检测，结果显示21株呈阳性，表明PAT基因和AGPS1反义基因均已整合进魔芋基因组。     

新疆大叶紫花苜蓿(Medicago sativa.L)子叶、下胚轴、根的植株再生

随着植物抗逆性研究和植物转基因技术的发展,通过异源目的基因转化培育耐盐碱苜蓿品种的研究已引起人们的关注,植物受体高频再生体系的建立是异源转化高效的基础。选取新疆大叶紫花苜蓿种子萌发5～7d无菌苗的子叶、下胚轴及根为外植体,诱导愈伤培养基为MS 2,4-D0.1～3.0mg/L(8种不同水平)或MS 2,4-D2.0mg/L KT0.01～0.5mg/L(10种不同水平),诱导芽培养基为MS 6-BA0.5mg/L NAA0.05mg/L,生根培养基为MS。结果表明,外植体在MS 2,4-D2.0mg/L KT0.2mg/L培养基中能够产生状态较好可再分化的愈伤组织,子叶、下胚轴、根的平均出愈率分别为93.1%、100%、100%。愈伤组织在MS 6-BA0.5mg/L NAA0.05mg/L培养基中培养40～80d中均可分化芽,子叶、下胚轴、根的芽平均分化率为50%、78%、50%,将2cm以上的芽转入MS培养基中诱导生根,14d后,生根的小植株炼苗移入花土中,成活率达90%以上。子叶、下胚轴、根在该体系中均能获得再生植株,根也是一种较好的植株再生材料,以根为外植体进行植株再生的研究报道还较少。     

Plant Regeneration from Immature Inflorescence Culture and Genetic Transformation of Wheatgrass (Agropyron cristatum × A. Desertorum cv. Hycrest-Mengnong)

The plants of hybrid wheatgrass (A. Cristatum ×A. Desertorum cv. Hycrest-Mengnong) were directly induced from embryogenic callus regenerated from immature inflorescence. Immature inflorescence was cultured on improved MS medium containing 2.0-3.0 mg L-1 2,4-D to regenerate callus. The calli were then transferred to hormone-free MS medium for differentiation and 1/2 MS medium for rooting. Results showed that callus initiation frequency was 83.4% and plant regeneration frequency was 59.6%. Phosphinothricin acetyltransferase (bar) gene was transformed into the hybrid wheatgrass by particle bombardment. Resistant callus was obtained using selecting agent, herbicide glufosinate of 0.5 mg L-1, and some transgenic plants were recovered in vitro. The transgenic plants were identified by PCR and Southern blot analysis and these plants developed normally in the glufosinate medium, whereas the nontransgenic plants did not. The results demonstrated that bar cDNA integrated into the genomic DNA of the transgenic plants. The transgenic frequencies of bar gene were 1.1%.     

Study on the Obtaining of Transgenic Wheat with GNA Alien Gene by Biolistic Particle

The immature embryos of wheat plants, cv. Jing 411, 12 - 14 days after pollination, were cultured on SD2 medium for callus induction. After 10 days culture, 800 wheat calli were bombarded by biolistic particle coated with theDNA of plasmid pBI121-2 harboring both Galanthus nivalis agglutinin gene and bar gene. 67 green plants were finally regenerated from the bombardment calli on selection medium containing 4mg/L Basta. The results of bioassay by both inoculating wheat aphids onto the plants and applying Basta solution of 50 mg/L and 75 mg/L onto the wheat leaves in the field, and the molecular analysis, such as PCR and Southern blotting, indicated that 8 T2 plants contaning the target genes were obtained.     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。