基于MPCR法检测抗虫与耐除草剂转基因玉米Bt1

为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系。结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT=0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测。     

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为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系.结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT =0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测.     

GmDREB8在大豆干旱胁迫下的功能分析

[目的]本研究旨在解析大豆DREB(dehydration responsive element-binding protein)转录因子基因GmDREB8与干旱胁迫的关系，为DREB转录因子参与大豆干旱胁迫的分子机制研究奠定基础，也为大豆耐旱转基因育种提供新的基因资源。[方法]以大豆品种‘天隆1号’为试材，通过荧光定量PCR(RT-qPCR)分析10个DREB基因在干旱胁迫诱导下的表达模式及GmDREB8在大豆不同组织和植物激素处理下的表达。采用生物信息学方法分析GmDREB8保守基序和亚细胞定位。通过农杆菌介导的烟草瞬时表达体系进行GmDREB8蛋白的亚细胞定位。分别在拟南芥中异源表达GmDREB8和利用VIGS(virus-induced gene silencing)技术在大豆中沉默GmDREB8,分析该基因在拟南芥和大豆干旱胁迫中的功能。[结果]10个DREB基因在干旱胁迫下都被诱导表达，但这10个基因间表达谱存在差异。筛选并克隆得到GmDREB8,其位于大豆17号染色体上，含有1个AP2结构域，蛋白相对分子质量为19.79×10³,pI为9.76。Gm...     

不同浓度磷胁迫对大豆幼苗生长及根系DNA甲基化水平的影响

为明确不同浓度磷胁迫对大豆幼苗生长及基因组DNA甲基化水平的影响，采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析大豆材料‘CP016’的幼苗在不同浓度磷胁迫下根系DNA甲基化水平和相关基因的表达量变化。结果表明:1)随着磷浓度的逐渐增加，大豆幼苗的株高、鲜重、根长和根表面积呈先升高后降低的趋势，无磷和高磷胁迫(1 000 μmol/L)均显著抑制大豆的生长，低磷胁迫(100 μmol/L)促进地上部生长，极低磷胁迫(10 μmol/L)促进根系生长；2)随着磷浓度的逐渐增加，大豆幼苗根系中的POD和CAT活性呈先降低后升高的趋势，SOD活性、淀粉和蔗糖含量呈先升高后降低的趋势；3)MSAP分析表明，随着磷浓度的增加，大豆幼苗根系DNA甲基化率和全甲基化率逐渐升高。具体来说，在无磷、正常供磷和高磷处理下，大豆幼苗根系的DNA甲基化率分别为43.04%、48.52%和51.05%；4)qRT-PCR分析结果表明，无磷胁迫下，调控大豆幼苗根系POD活性和淀粉合成相关基因以及甲基化酶基因DRM2的表达量显著升高；调控SOD活性和蔗糖合成相关基因以及去甲基化酶基因ROS1的表达量显著降低。本研究表明，无磷和高磷胁迫显著抑制大豆的生长，并使其抗氧化酶系统紊乱，淀粉和蔗糖含量降低，但适度的低磷胁迫可以促进大豆幼苗的生长。无磷和高磷胁迫分别降低和提高大豆幼苗根系的DNA甲基化水平。     

转桃PpCuZnSOD基因大豆的耐旱性

为探索桃(Prunus persica L.)铜/锌超氧化物歧化酶基因(PpCuZnSOD)在植物抗干旱胁迫中的作用,应用农杆菌介导法,将PpCuZnSOD基因转入大豆品种中黄13中。Southern印迹分析证实PpCuZnSOD基因已整合到大豆基因组中。定量PCR分析结果表明,转基因大豆中PpCuZnSOD表达水平均明显增加。用15%PEG4000模拟干旱胁迫时,转基因大豆种子萌发率与主根长显著高于非转基因大豆。在干旱10 d条件下,转基因大豆与非转基因大豆相比,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性增加,而丙二醛(MDA)含量下降,叶绿素含量降低较少。活性氧(ROS)染色结果显示,转基因植株在干旱胁迫下活性氧少于非转基因植株。复水后4 d,转基因大豆的成活率显著高于非转基因大豆。这些结果表明,PpCuZnSOD能提高大豆的耐旱性。     

大豆GmPR10基因克隆与植物表达载体的构建

为探明大豆中PR10蛋白质基因的抗大豆花叶病毒(SMV)作用机理,从抗SMV材料中克隆到GmPR10基因完整的cDNA序列,GmPR10基因的开放阅读框(ORF)全长477 bp,编码158个氨基酸。序列比对与进化树分析结果表明：GmPR10是大豆中一个新的PR10蛋白质基因,GmPR10基因在大豆的根、茎、叶中均能表达,接种大豆SMV后该基因在大豆叶片中被强烈诱导并高效表达,推测其可能使植物本身获得系统抗性以抵抗外来病原菌的侵袭。该研究构建了GmPR10基因的植物表达载体,为探究GmPR10基因在大豆抗病中的分子作用机理打下了基础。     

黄淮地区大豆种质资源对疫霉根腐病的抗病性评价

【目的】建立一套大豆抗疫霉菌根腐病基因鉴别菌系,并用于分析大豆品种(系)是否含有抗病基因Rps1a、Rps1c和Rps1k。【方法】采用下胚轴接种法测定了125个大豆疫霉菌分离物的毒性组成,筛选了不同毒力公式的6个大豆疫霉菌并建立了该菌系,测定了黄淮地区55个主栽大豆品种(系)对该菌系的抗性并通过基因推导方法进行抗病基因分析。【结果】55个大豆品种(系)共产生18种反应型。抗病基因的推导结果表明,有2个品种可能含有Rps1c,没有鉴定到可能携带有Rps1a或Rps1k的大豆品种(系)。【结论】黄淮地区携带抗病基因Rps1a、Rps1c和Rps1k的大豆品种(系)并不多,且易感疫霉菌,因此需要及时进行抗性育种并积极推广。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑的高油酸大豆品系创制

高油酸能够显著提升大豆食用油的稳定性和食用价值，是大豆品质改良的育种目标之一。为提高大豆籽粒油酸含量，本研究采用CRISPR/Cas9多基因编辑技术，同时敲除负调控大豆油酸含量的2个关键基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B。采用农杆菌介导的大豆子叶节转化方法获得20株T₀代阳性苗，但发生基因编辑的株系只有11个，其中GmFAD2-1A发生突变的有7株，GmFAD2-1B发生突变的有10株，这2个基因同时发生突变的有6株。经过加代纯合后，检测转基因株系(T₃代)大豆籽粒的脂肪酸组分，发现油酸含量显著提升，最高达81.38%,而亚油酸含量则显著降低，获得了高油酸新种质。本研究采取多基因敲除策略，成功突变大豆基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B,并获得高油酸大豆突变体株系，为高油酸大豆育种提供了新的种质资源。     

VgDGAT1A转基因大豆高代材料的表型分析

[目的]二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是植物三酰甘油(TAG)合成的最后一步限速酶,对油脂积累至关重要,可用于提高大豆(Glycine max)种子油含量。[方法]本文将来自富油植物斑鸠菊(Vernonia galamensis)发育种子的VgDGAT1A基因转入大豆品种Jack,进一步培育获得VgDGAT1A转基因大豆高代品系。通过qRT-PCR检测VgDGAT1A基因在大豆种子发育中期的表达情况及其引起的脂肪酸含量变化。[结果]连续多代跟踪检测表明,这些大豆品系中VgDGAT1A基因稳定整入染色体,并有效表达。与野生型大豆(Jack)相比,转基因大豆种子油脂含量平均提高5.1%,没有其它不良表型。[结论]VgDGAT1A基因确实能够在大豆种子发育过程中促进油脂合成累积,从而提高大豆种子的总体含油量。这些富油转基因品系可进一步用于培育高油大豆品种,以及大豆种子油脂合成积累及其调控机制的研究。     

复合PCR方法检测抗草甘膦大豆MON89788

根据抗草甘膦大豆MON89788分子特征,选择大豆内源参照基因(Lectin)、玄参花叶病毒启动子(P-FMV 35S)、豌豆终止子(T-E93')和目的基因(CP4-epsps)4个基因作为复合PCR检测基因,其特异性引物序列参照国家相关标准,对反应条件进行优化并测试其特异性和灵敏度。最终建立了可同时检测除内源基因在外的3种外源基因复合PCR检测体系。     

进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测

【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus,BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）,建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设计2对特异性引物,以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料,提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测,测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA,将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释,依次稀释为原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍作为模板,分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增,测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后,连接于pMD18-T载体,进行克隆测序和序列比对,进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测,同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管,将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合,建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示,最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L^-1、SMV 0.4 μmol·L^-1,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为35。特异性测定结果表明,多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 bp特异性目的条带,从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 bp特异性目的条带,从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 bp特异性目的条带,而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果表明,当dsRNA原液稀释至10^-3倍时,无论是多重RT-PCR,还是单一RT-PCR均未扩增出特异性目的条带,多重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏度相当,为10^-2倍dsRNA原液。多重RT-PCR扩增产物克隆测序和序列比对结果显示,BPMV、SMV所测的序列全长分别为542和221 bp,与预期大小完全相符,且与已报道的各病毒基因序列高度同源,证实了多重RT-PCR结果的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法分别对来自于4个国家的大豆种子样品进行检测,结果从3份美国大豆种子样品检出BPMV,1份美国大豆种子检出SMV,1份阿根廷大豆种子检出SMV,2份中国大豆种子检出SMV,该结果与单一RT-PCR验证结果一致,阳性符合率达100% 。建立的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子中成功扩增出2条特异性目的条带,而从健康大豆种子中未扩增出特异性目的条带。【结论】建立的多重RT-PCR检测方法为进境大豆种子上BPMV、SMV的快速检测提供了参考。     

脂肪酸环氧化酶SlEPX转基因大豆的表型分析

【目的】 植物源环氧化脂肪酸（epoxy fatty acids,EFAs）是生产高值化工产品的优异可再生原材料。EFAs仅在一些野生植物种子中高水平合成和积累,难以规模化利用。通过在普通油料作物大豆（Glycine max (L.) Merr.）发育种子中组装环氧化脂肪酸合成途径,以期实现这类珍稀脂肪酸（unusual fatty acids,UFAs）的商业化绿色生产。【方法】 通过构建琉璃菊（Stokesia laevis）脂肪酸环氧化酶（epoxygenase,SlEPX）基因种子特异表达载体,基于体细胞胚发生的粒子轰击法对大豆（cv. Jack）进行遗传转化,经连续选择和鉴定,获得表型稳定的高代转基因大豆株系。分别运用PCR和实时荧光定量PCR检测外源基因SlEPX的整合及在大豆发育种子中的表达谱。统计分析SlEPX转基因大豆籽粒形态和大小、百粒重以及种子萌发率等表型,应用气相色谱和凯氏定氮法测试种子油脂和蛋白等相关生理生化特性。【结果】 外源基因SlEPX稳定整合于大豆基因组,且能在高代转基因大豆发育种子中正确有效表达。SlEPX转基因大豆种子新合成积累了2.9%的EFAs,相应的亚油酸（18﹕2Δ9,12）含量减低8%。与对照相比,SlEPX转基因大豆种子变长,表皮多皱褶。种子大小测量显示,转基因大豆小粒种子（粒径<4 mm）占比明显增加。转基因与对照大豆的种子发芽率无明显差异,然而转基因植株生长缓慢。转基因大豆种子油脂含量、蛋白质含量和百粒重分别减少5%、6%和8.28%。进一步生化分析发现,转基因大豆新合成的EFAs,绝大部分结合于卵磷脂（phosphatidylcholine,PC,占12.6%）分子,仅少量结合于甘油三酯（triacylglycerol,TAG,占2.3%）。这些数据表明在转基因大豆种子中,外源SlEPX酶能正确催化亚油酸（18﹕2Δ9,12）生成环氧化脂肪酸即斑鸠菊酸（vernolic acid,Va）(12-epoxy-18﹕1Δ9）。但是,绝大多数斑鸠菊酸积累于构成细胞膜的主要成分PC分子中,而没有转移整合进入贮藏的TAG分子。大量新合成的斑鸠菊酸结合于PC分子可能损伤宿主细胞膜稳态和生理反应,导致转基因大豆产生不利表型。【结论】 在大豆发育种子中单独表达外源脂肪酸环氧化酶,能催化合成少量EFAs,但同时产生一些不利表型。在SlEPX转基因大豆种子中共表达DGAT或PDAT,既可实现环氧化脂肪酸在TAG中富集,同时还能消除环氧化脂肪酸在细胞膜中的积累及其所导致的负效应。     

不同浓度的硒对大豆种子发芽率及幼苗生长的影响

研究了不同硒处理浓度对大豆种子萌发率、种子活力指数、发芽指数和发芽势等的影响。试验结果表明,适宜的硒浓度处理提高了大豆种子的发芽率,增加了发芽势和发芽指数,提高了活力指数,也使大豆根的鲜重有所提高,其中硒的浓度在0.05 mg.-1时,对大豆种子萌发最有利。但是过高的浓度对大豆种子的发芽有明显的抑制作用。     

大豆无菌苗的获得

采用升汞和次氯酸纳两种消毒剂对野生大豆和栽培大豆进行处理 ,获得大豆的无菌苗。结果表明 :①野生大豆对消毒剂的抵抗能力明显高于栽培大豆 ;②用水浸泡的栽培大豆再用升汞和次氯酸纳处理时 ,都不能发芽或极少发芽 ,说明消毒剂对浸泡的栽培大豆伤害十分严重 ;③种子放置在固体培养基的表面生长较快。     

生殖生长期温度对大豆各器官维生素E及其组分含量影响

研究以α-生育酚含量水平不同的两个大豆品种北丰9(高)和龙选1号(低)为试验材料,在大豆生殖生长期利用光照培养箱以三个温度处理(28~34℃、22~28℃、16~22℃),研究不同温度对大豆茎、叶、荚皮、籽粒维生素E含量影响。结果表明,随温度升高,大豆茎中α-生育酚、γ-生育酚和维生素E总含量降低(P0.01),叶片中α-生育酚和维生素E总含量降低(P0.01),籽粒中γ-生育酚、δ-生育酚和维生素E总含量降低(P0.01),而籽粒中α-生育酚增加(P0.01)。中等温度(22~28℃)更有利于大豆荚皮中δ-生育酚和VE总含量积累,而低温(16~22℃)不利于α-生育酚和γ-生育酚积累。高温条件能提高α-生育酚从叶、茎和荚皮向籽粒中转化运输率(P0.01),有利于大豆籽粒中α-生育酚含量积累。     

大豆种子浸提液对大豆花叶病毒侵染力的抑制效应

本文介绍了用枯斑反应法研究大豆种子的磷酸缓冲液提取物对大豆花叶病毒(SMV)侵染力的影响。试验结果表明:1.成熟大豆种子内含有抑制 SMV 侵染的物质。成熟种子的浸提液对 SMV 侵染抑制率为50%左右;2.大豆不同品种的成熟种子浸提液对 SMV 侵染的抑制作用无差异;3.成熟大豆种子的浸提液对SMV 的不同株系的抑制作用无差异;4.成熟大豆种子浸提液在100℃下加热10分钟后,其抑制效力不变;5.大豆未成熟种子浸提液对 SMV 的侵染力无抑制作用;6.菜豆和眉豆成熟种子浸提液对 SMV 的侵染力具有与大豆成熟种子浸提液相似的抑制效应。     

春大豆翻秋及秋大豆窄行密植的研究

研究结果表明:窄行密植(春大豆翻秋的行、株距为20cm×6.7cm,秋大豆20cm×7.4cm)可以极显著地提高春大豆的产量,较常规种植(CK)增产22.2%～80.26%;也可以显著地提高秋大豆的产量,较CK增产9.20%～20.57%。随着种植密度的增加和行距的缩小,大豆株高增加,结荚部位提高,分枝数减少,单株荚数、粒数及粒重降低,但单位面积荚、粒数增加。     

重茬对辽宁省大豆品质指标及其产量的影响

为了探讨重茬对大豆各方面的影响,解决生产实践中大豆重茬对产量和品质的影响,采用裂区设计试验,研究重茬条件对辽宁省大豆品种的外观品质、营养品质和产量的影响,结果表明:与正茬相比,重茬种植使大豆籽粒的外观品质变劣,表现在病粒率和虫食粒率增加,百粒重显著降低;重茬对大豆籽粒的营养品质影响较大。与正茬相比,籽粒的蛋白质含量显著增加,同时脂肪含量显著降低,蛋白质和脂肪总含量显著增加,且品种之间存在差异。在重茬条件下,铁丰30号的外观品质、营养品质和产量都表现相对较好,铁丰29号、辽豆13号的品质和产量则表现相对稳定,这3个品种可能为重茬条件下较高产、优质的耐性品种;而铁丰31号虽然重茬对其品质、产量影响较大,但因自身在品质和产量方面表现突出,重茬种植也能获得较好的品质和较高的产量。     

中国大豆脂肪氧化酶缺失种质多样性鉴定研究

应用改进的IEF电泳方法,对中国26个省、市（区）的895份大豆资源进行脂肪氧化酶缺失类型鉴定;对IEF电泳图谱进行激光扫描分析,比较品种间各条同工酶带活性差异;研究脂肪氧化酶的缺失与籽粒颜色、百粒重、播种期类型及生育期的关系;通过生物体系超弱发光动力学分析,研究种子发芽前后脂肪氧化酶缺失体活性动态变化。结果表明：在中国大豆资源中发现了4种脂肪氧化酶缺失体类型,鉴定出43份缺失突变体,占鉴定总数的4.80%;脂肪氧化酶的缺失与籽粒颜色和播种期类型有关,其中褐色、黑色大豆缺失频率较高;萌动种子发芽前,正常大豆的超弱发光强度明显高于脂肪氧化酶缺失体的发光强度,探索用超弱发光强度鉴别脂肪氧化酶缺失体的可能性。此外,还研究制定了一套快速、简便的大豆脂肪氧化酶鉴定技术,为种质创新研究及开发食品资源提供鉴定方法。     

Constitutive expression of feedback-insensitive cystathionine γ-synthase increases methionine levels in soybean leaves and seeds

Soybean(Glycine max(L.) Merr.) is a major crop that provides plant-origin protein and oil for humans and livestock.Although the soybean vegetative tissues and seeds provide a major source of high-quality protein,they suffer from low concentration of an essential sulfur-containing amino acid,methionine,which significantly limits their nutritional quality.The level of methionine is mainly controlled by the first unique enzyme of methionine synthesis,cystathione γ-synthase(CGS).Aiming to elevate methionine level in vegetative tissues and seeds,we constitutively over-expressed a feedback-insensitive Arabidopsis CGS(At D-CGS) in soybean cultivars,Zigongdongdou(ZD) and Jilinxiaoli 1(JX).The levels of soluble methionine increased remarkably in leaves of transgenic soybeans compared to wild-type plants(6.6-and 7.3-fold in two transgenic ZD lines,and 3.7-fold in one transgenic JX line).Furthermore,the total methionine contents were significantly increased in seeds of the transgenic ZD lines(1.5-to 4.8-fold increase) and the transgenic JX lines(1.3-to 2.3-fold increase) than in the wild type.The protein contents of the transgenic soybean seeds were significantly elevated compared to the wild type,suggesting that the scarcity of methionine in soybeans may limit protein accumulation in soybean seeds.The increased protein content did not alter the profile of major storage proteins in the seeds.Generally,this study provides a promising strategy to increase the levels of methionine and protein in soybean through the breeding programs.