植物甲羟戊酸激酶基因研究进展

类异戊二烯是维持植物生长发育、光合作用等所必需的重要有机物质,包括叶绿素、生长调节剂等多种重要物质,是通过甲羟戊酸代谢途径中一系列酶促反应合成的。本文综述了该途径中的限速酶之一甲羟戊酸激酶的生物学特性、酶促反应机理、基因克隆、基因转化等方面的研究进展,旨在为其在作物改良中的应用提供依据。     

担子菌中甲羟戊酸途径影响萜类物质合成的研究

担子菌中具有多种萜类活性物质,这些活性物质对人类的营养和健康有着很重要的影响。甲羟戊酸途径是担子菌合成萜类物质的一条主要途径,萜类物质的含量水平受到甲羟戊酸途径的控制,但是生物细胞内萜类物质的产量很低,并且目前活性萜类物质的化学以及生物合成方法效率低、成本高,因此为了能够更好的增加萜类物质在担子菌细胞内的产量,介绍了担子菌甲羟戊酸途径中乙酰辅酶A、HMG\|CoA、甲羟戊酸激酶影响萜类物质的合成作用,旨在通过调控这些物质来增加目标萜类物质的产量。     

克隆和鉴定橡胶树中两个DXR的cDNA

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）是2C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途径中第二个酶，该途径是植物内合成类异戊二烯化合物途径中的其中一条。产生胶乳被认为是主要来自甲羟戊酸（MVA）途径。通过RT—PCR方法，从橡胶树叶和胶乳中分离出来的两个DXR的cDNA，分别命名为HbDXR1和Hb-DXR2。     

药用植物中HMGR的生物信息学分析

药用植物中萜类的次生代谢产物不但种类丰富,而且数量巨大,其药理活性也很突出。3-羟基-3-甲基戊二跌辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)作为三萜皂苷主要代谢通路甲羟戊酸(MVA)途径中的第一个重要限速酶,也是此途径中的重要调控点。将NCBI数据库中公布的所有药用植物HMGR蛋白序列进行整理,并分别利用BLAST和Mega6.0软件进行在线分析和构建分子进化树,发现亲缘关系较近的74%紫草HMGR(丹参)、74%龙胆HMGR(丹参)、78%长春花HMGR(丹参)、81%西洋参HMGR(桔梗)。为进一步研究HMGR基因序列在萜类代谢通路中的其它作用,以及是否还存在HMGR家族中的其它基因序列提供借鉴。     

4种大戟科植物PMK基因家族的全基因组鉴定与分析

甲羟戊酸-5-磷酸激酶（PMK）是甲羟戊酸（MVA）途径中的关键酶,其在ATP和Mg2＋等二价金属离子的存在下可逆地催化甲羟戊酸-5-磷酸（MVAP）磷酸化从而形成甲羟戊酸-5-焦磷酸（MVAPP）.基于已公布的基因组和EST数据,对蓖麻、麻疯树、木薯和橡胶树4种大戟科植物的PMK基因进行系统鉴定,分析其基因结构与进化特征.结果表明,蓖麻、麻疯树、木薯和橡胶树分别含有1、1、1和2个PMK基因,所有基因均含有9个内含子.根据同源性,PMK基因可分为2类,Ⅰ类广泛分布于绿色植物和部分古细菌、真细菌和真菌中,Ⅱ类则为动物所特有;虽然绝大多数绿色植物都含有PMK,但基因组范围内的搜索却未能在单细胞的绿藻中找到其同源基因;在大多基因组已测序的物种中,PMK主要以单拷贝的形式存在,其中包括蓖麻、麻疯树和木薯,但在橡胶树中基因出现了加倍现象,这与玉米和杨树类似.基因表达谱分析显示,在叶片、花、Ⅱ/Ⅲ期胚乳、Ⅴ/Ⅵ期胚乳和种子等组织中,RcPMK在Ⅱ/Ⅲ期胚乳中的表达丰度较高,叶片、种子和花次之,而在Ⅴ/Ⅵ期胚乳中的表达丰度最低.     

植物查尔酮合成酶分子生物学研究进展

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74),是植物类黄酮物质合成途径中的第一个酶,也是植物次生代谢途径中的关键酶之一,对植物具有非常重要的生理意义。为此,综述了查尔酮合成酶基因结构、基因进化、表达调控机理以及诱导因子,概述了查尔酮合成酶基因工程在植物生理方面的研究,并进一步对查尔酮合成酶的分子生物学研究做了展望。     

生态因子对黄芪甲苷合成及其关键酶基因表达的影响

以二年生膜荚黄芪为试验材料,探究生态因子对膜荚黄芪根中黄芪甲苷含量及其关键酶基因表达量的影响.测定二年生黄芪的黄芪甲苷含量,并采用实时荧光定量PCR分析黄芪甲苷合成途径中7个关键酶:乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AACT)、甲羟戊酸激酶(PMK)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)、异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、角鲨烯合酶(SS)、角鲨烯环氧酶(SE)基因表达量.结果表明:光合有效辐射、土壤湿度、温度、降雨量、最大降雨强度均会影响根部黄芪甲苷合成,其中温度和光合有效辐射与黄芪甲苷含量呈显著正相关(P＜0.05),土壤湿度、降雨量、最大降雨强度与黄芪甲苷含量呈负相关.黄芪甲苷合成关键酶基因在黄芪甲苷积累的重要时期表达较高,黄芪甲苷合成关键酶基因的表达相互影响,膜荚黄芪根中关键酶基因的表达对黄芪甲苷积累大多为正相关关系;其中PMK基因与黄芪甲苷含量呈显著正相关(P＜0.05),为主要调控基因.     

环境因子对黄酮代谢的影响及其分子机制

黄酮是植物体内一类重要的代谢物,它们不仅对植物的生长、发育及适应性等方面有重要的调节作用,而且含有很多活性成分具有良好的药用价值。本文综述了黄酮类物质在植物和药理方面的重要作用,介绍了其代谢途径以及代谢中的重要基因和酶。同时本文还介绍了阳光、紫外辐射和水分等环境因子对黄酮代谢中的重要基因的调控,并阐明环境因子对黄酮代谢产生影响的分子机制。     

类黄酮物质及查尔酮合酶在油菜性状改良中的作用

类黄酮化合物(Flavonoids)是一类重要的植物次生代谢产物,查尔酮合酶(CHS)是类黄酮物质形成步骤中的一个关键酶,影响植物的多种重要性状.油菜是重要的经济作物,许多植物的CHS基因已经被克隆并进行了基因工程的研究,但CHS与油菜性状发育的关系和分子机理的研究还十分欠缺.本文简略综述了类黄酮物质的结构、分布、功能、CHS基因在类黄酮途径中的重要作用、植物界CHS基因克隆和基因工程的研究进展,重点论述了CHS在油菜的种皮色泽、花瓣颜色、异花传粉、花粉育性、抗紫外线能力、茎表紫色、抗病能力等性状形成中可能的重要作用,并提出了通过对CHS基因的表达调控来改良这些性状的可能性.     

苯丙烷代谢途径中细胞色素P450的研究

苯丙烷次生代谢途径通过合成木质素、类黄酮等多种次生物质而影响植物的许多重要性状。细胞色素P450超家族参与苯丙烷途径的至少16种关键酶反应。从蛋白特征、功能、编码基因、表达调控等角度,综述了公共苯丙烷和主要分支途径中的细胞色素P450,如肉桂酸-4-羟化酶、类黄酮-3’-羟化酶、类黄酮-3’5’-羟化酶、阿魏酸5-羟化酶等。     

The mevalonate pathway controls heart formation in Drosophila by isoprenylation of Ggamma1

The early morphogenetic mechanisms involved in heart formation are evolutionarily conserved. A screen for genes that control Drosophila heart development revealed a cardiac defect in which pericardial and cardial cells dissociate, which causes loss of cardiac function and embryonic lethality. This phenotype resulted from mutations in the genes encoding HMG-CoA reductase, downstream enzymes in the mevalonate pathway, and G protein Ggamma1, which is geranylgeranylated, thus representing an end point of isoprenoid biosynthesis. Our findings reveal a cardial cell-autonomous requirement of Ggamma1 geranylgeranylation for heart formation and suggest the involvement of the mevalonate pathway in congenital heart disease.     

牛巴贝斯虫DXS基因的克隆和真核表达

【目的】顶质体是存在于包括疟原虫和巴贝斯虫在内的顶复门寄生虫的一种细胞器,在病原体中,它主要承载类异戊二烯前体和脂肪酸合成途径,异戊二烯五碳结构是有机体合成多种化合物的结构基础,对有机体生命活动至关重要,例如,在哺乳动物中成为胆固醇和类固醇激素的基本结构,在植物中参与合成类胡萝卜素。且存在于顶质体的类异戊二烯前体合成途径对于病原体的生命活动至关重要且不存在于人类和哺乳动物机体,这使其成为近年来人们研究抗原虫药物的焦点。有学者发现利用特异性阻断类异戊二烯代谢途径的药物可治疗疟疾。1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶（DXS）为该途径中的第一个限速酶。因此,针对牛巴贝斯虫的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶dxs基因进行克隆和序列分析,并对其进行真核表达和活性检测,以期获得具有活性的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶,为进行针对该酶的特异性抑制剂的筛选奠定基础。【方法】首先采用反转录PCR技术从牛巴贝斯虫陕县株总RNA中扩增出DXS基因的全长cDNA,并对其进行克隆测序,对测序结果进行序列分析,将阳性克隆亚克隆至带荧光标签的真核表达载体,利用脂质体转染法将重组真核表达质粒转染至Hela细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染细胞的表达情况,消化收集转染细胞,通过超声破碎后采用Western blot技术对DXS蛋白的表达情况进行检测,结合G418压力筛选以及有限稀释的方法对转染阳性细胞进行筛选,获得阳性单克隆细胞。在体外建立DXS酶反应体系,并利用液相质谱联用技术对表达产物的体外活性进行检测。【结果】扩增得到的DXS基因全长共2 061 bp,共编码686个氨基酸,与GenBank上T2Bo株相应基因相似性达到98.0%。利用生物信息学方法对该蛋白质的二级结构进行分析发现,该酶具有3个结构域,分别是焦磷酸硫胺素结合区域;焦磷酸硫胺素嘧啶环结合区域;转酮醇酶C端区域,该酶属于常见的TPP依赖蛋白酶家族。通过倒置荧光显微镜观察,转染重组质粒后的Hela细胞呈现绿色荧光,Western blotting结果显示融合绿色荧光蛋白的DXS酶大小约为102 kD,表明构建的真核表达重组质粒在Hela细胞中进行了正确的表达。通过结合G418加压和有限稀释法筛选得到稳定转染重组质粒PEGFG-DXS的阳性单克隆细胞。利用质谱技术检测到在细胞粗提物与反应混合物反应后的产物中有分子量与DOXP相同的产物存在,在阳离子模式下m/z=237,表明表达产物具有催化活性。【结论】成功的表达了具有活性的牛巴贝斯虫DXS酶,并对融合蛋白的活性进行了定性分析,为今后开展针对DXS酶的特异性化合物体外高通量筛选研究提供了材料。对研究针对DXS为靶标的抗原虫药物具有重要意义,为深入研究该酶的酶学性质和特异性抑制剂筛选奠定了基础。     

Genetic and pharmacological suppression of oncogenic mutations in ras genes of yeast and humans

The activity of an oncoprotein and the secretion of a pheromone can be affected by an unusual protein modification. Specifically, posttranslational modification of yeast a-factor and Ras protein requires an intermediate of the cholesterol biosynthetic pathway. This modification is apparently essential for biological activity. Studies of yeast mutants blocked in sterol biosynthesis demonstrated that the membrane association and biological activation of the yeast Ras2 protein require mevalonate, a precursor of sterols and other isoprenes such as farnesyl pyrophosphate. Furthermore, drugs that inhibit mevalonate biosynthesis blocked the in vivo action of oncogenic derivatives of human Ras protein in the Xenopus oocyte assay. The same drugs and mutations also prevented the posttranslational processing and secretion of yeast a-factor, a peptide that is farnesylated. Thus, the mevalonate requirement for Ras activation may indicate that attachment of a mevalonate-derived (isoprenoid) moiety to Ras proteins is necessary for membrane association and biological function. These observations establish a connection between the cholesterol biosynthetic pathway and transformation by the ras oncogene and offer a novel pharmacological approach to investigating, and possibly controlling, ras-mediated malignant transformations.     

橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,命名为TKFPS（GenBank登录号 KJ558350.1）。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 kD,理论等电点（pI）为5.41,平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,TKFPS 蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低。重组子pCAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。     

蕨麻猪生长激素基因的克隆及多态性分析

[目的]探索蕨麻猪生长激素基因与其生理学和生物学特性的关系。[方法]从蕨麻猪血液细胞中提取基因组DNA,通过PCR技术扩增出蕨麻猪生长激素基因序列,进行碱基组成多态性和突变分析。[结果]蕨麻猪生长激素（pGH）基因序列全长1671bp,有5个外显子和4个内含子。外显子1、2、3、4和5的碱基数依次是10、161、117、162和201bp,内含子1、2、3和4的碱基数分别是244、210、192和277bp。除第1外显子和第1内含子碱基剪切有明显的例外,其余全部符合GT-AG规则;蕨麻猪生长激素基因4种碱基含量依次为G〉C〉T〉A。（G＋C）含量和（A＋T）含量分别在62%和37%以上。蕨麻猪编码区第4外显子在＋1046位处A→G,为错义突变,其余均为同义突变。蕨麻猪生长激素基因编码的前体蛋白含216个氨基酸,成熟蛋白是由190个氨基酸残基组成的一个分泌性蛋白;二级结构中含有6个α螺旋结构,三级结构是结构松散的球状蛋白,含有6个α螺旋前区。[结论]为蕨麻猪生长激素基因序列的研究提供了参考依据和借鉴。     

Comparison of biological properties and transforming potential of human PDGF-A and PDGF-B chains

Human platelet-derived growth factor (PDGF) consists of two distinct but related polypeptide chains designated PDGF-A and PDGF-B. The gene encoding PDGF-B has given rise to the v-sis oncogene. In the present study the transforming activities of PDGF-A and PDGF-B genes are compared. The PDGF-A chain gene is markedly less efficient in inducing transformation than the PDGF-B gene under the influence of the same promoter. There are significant differences in the secretory and growth stimulating properties of the two chains. These properties appear to account for the much more potent transforming ability of the PDGF-B gene. These findings provide insights into biologic properties of a growth factor responsible for potent autocrine stimulation of abnormal cell proliferation.     

贵州矮马与伊犁马生长激素基因5’侧翼区的结构特征

为了摸索贵州矮马生长发育的调控机制,探明贵州矮马与伊犁马生长激素基因5’侧翼区的结构特征,以4～5龄的贵州矮马和7～8龄的新疆伊犁马为研究对象,采用直接测序法从两种马基因组中克隆了生长激素(GH)基因5’侧翼区的DNA序列,并进行生物信息学分析。结果表明:1)从基因组中克隆的711bp片段为GH基因5’侧翼区序列;2)两个马品种的GH基因5’侧翼区中都存在TATA box、CAATbox、GC box和Octamer位点等真核生物启动子结构;3)从伊犁马GH基因5’侧翼区中检测到1个位于30bp处的突变位点发生了G→C颠换,由此新增了1个转录因子upstream stimulatory factor(USF)结合位点;4)从贵州矮马和伊犁马GH基因的5’侧翼区序列中发现了MZF1、CdxA、Nkx-2、AML-1a和c-Myc等19种共58个转录因子的结合位点。结论:克隆的711bp基因序列中存在大量的转录调控元件。     

Cyclopentanoid terpene biosynthesis in a phasmid insect and in catmint

The stick insect, Anisomorpha buprestoides, and the catmint, Nepeta cataria, produce closely related cyclopentanoid terpenes, anisomorphal and nepetalactone. Tracer experiments with isotopes indicate that anisomorphal is synthesized by the walking stick from normal terpene precursors (acetate or mevalonate). In the catmint plant, isolated leaf disks synthesized nepetalactone, utilizing the same precursors.