转海藻糖合酶基因玉米株系的获得及其抗旱性研究

采用农杆菌介导玉米萌发种子转化方法,将海藻糖合酶基因(TPS)导入玉米自交系昌7-2中。PCR和Southern blot检测结果表明,目的基因已导入转化植株并整合到受体基因组上。田间抗旱性鉴定和生理生化指标结果显示,转基因植株(株系)的抗旱性明显高于对照。说明海藻糖合酶基因具有抗旱功能,利用植物基因工程技术对其进行玉米抗旱育种是切实可行的。     

一种利用花粉管结合农杆菌介导方法将iaaM基因导入玉米自交系的研究

[目的]利用花粉管结合农杆菌介导方法将iaaM基因导入玉米自交系。[方法]利用电击转化法将iaaM基因的表达载体转入农杆菌LBA4404菌株中,通过花粉管通道法将验证正确的菌株直接转化京24玉米自交系,最后通过除草剂筛选及PCR检测得到阳性植株。[结果]试验共得到12株抗性植株,其中10株为阳性植株。[结论]该研究成功建立了一种无需组织培养体系,直接利用花粉管通道进行农杆菌介导的玉米转化方法。     

利用花粉管结合线性DNA的方法将YB2基因导入玉米自交系的研究

[目的]将YB2基因导入玉米自交系。[方法]利用花粉管通道法将含有YB2基因的线性表达盒转入优良玉米自交系京24,对T0代植物喷洒浓度为200 mg/L草铵膦药液进行筛选,并对筛选到的植株进行PCR、RT-PCR检测。[结果]试验共得到19株草铵膦抗性植株;经检测,19株均为Bar阳性植物,其中5株含YB2目的基因,初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。[结论]该研究为获得抗旱性好、产量高、安全的转基因玉米株系奠定了基础。     

葡萄糖氧化酶基因转化玉米及其后代的抗病性研究

通过花粉管通道法将葡萄糖氧化酶基因(Glucose oxidase,GO)转入玉米自交系,并对转化后代进行了大斑病抗性鉴定。结果表明,授粉后15～20h为最佳外缘基因导入时间段,最适合的转化质粒DNA浓度为100μg·mL-1。转化获得卡那霉素抗性植株244株,PCR阳性植株13株,对转化的D0代PCR阳性植株的抗病性进行了大斑病抗性鉴定,部分转化植株的抗玉米大斑病能力有所提高,其中3株表现高抗。研究为探索大众化玉米转基因和培育抗病玉米自交系提供了新方法。     

利用花粉管结合线性DNA的方法将YB2基因导入玉米自交系的研究

[目的]将YB2基因导入玉米自交系.[方法]利用花粉管通道法将含有YB2基因的线性表达盒转入优良玉米自交系京24,对T0代植物喷洒浓度为200 mg/L草铵膦药液进行筛选,并对筛选到的植株进行PCR、RT-PCR检测.[结果]试验共得到19株草铵膦抗性植株;经检测,19株均为Bar阳性植物,其中5株含YB2目的基因,初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中.[结论]该研究为获得抗旱性好、产量高、安全的转基因玉米株系奠定了基础.     

DGAT1-2基因在超高油玉米中的转化、表达及对油脂含量的影响

【目的】三酰甘油是油料作物油脂的主要成分,二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)是催化三酰甘油合成唯一的关键酶和限速酶.探讨DGAT基因对超高油玉米Zea mays L.种子油分含量的影响,以进一步提高超高油玉米的含油率.【方法】采用花粉管通道法将DGAT1-2基因导入超高油玉米自交系,在盆栽条件下5~6叶期对T1代植株进行PCR检测筛选,Southern杂交进一步验证.成熟时收获10株自交授粉的转基因植株(T2代)籽粒,测籽粒平均含油率,通过t检验进行统计分析.【结果和结论】初步筛选获得假定转化植株163株,Southern杂交获29株转基因植株,平均转化率为1.44%.t检验结果表明,10株自交授粉的转基因植株(T2)籽粒平均含油率比非转基因植株籽粒平均含油率提高了6.19%,差异极显著(P0.01).利用花粉管通道法导入DGAT1-2基因,可显著提高超高油玉米籽粒含油率,是一种切实有效提高超高油玉米含油量的新途径.     

转植酸酶基因(phyA)玉米的PCR检测

采用CTAB法和SDS法对通过花粉管通道法导入植酸酶基因(phyA)的玉米植株,进行基因组提取并做了对比,认为SDS法效果更好,进而进行了PCR检测,并对PCR反应体系及反应条件进行优化,得出最适反应条件为57℃、模板含量1μL,检测得到了转基因阳性植株,初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。     

利用花粉管通道法将外源DNA导入玉米的研究进展

综述了外源DNA通过花粉管通道导入玉米的研究进展.详细阐述了利用花粉管通道法将外源DNA导入玉米中的转化方式、导入后代的变异以及变异机理;介绍了利用花粉管通道法将外源总DNA和目的基因导入到玉米中的研究现状;提出了利用花粉管通道法导入外源DNA应注意的问题,以及今后的研究方向.     

聚乙二醇和细胞穿膜肽介导提高玉米花粉管通道法转化效率

为探讨花粉管通道法加聚乙二醇（PEG）介导、加细胞穿膜肽（CPPs）介导与直接导入外源基因3种方式间的转化率差异，对2种玉米自交系材料京2416和京92进行花粉管通道法转化并统计分析。结果表明，3种方式均能获得草甘膦抗性植株，在京2416受体中PEG介导较直接导入高0.45百分点，CPPs介导的较直接导入的高0.66百分点，三者间转化率差异达显著或极显著水平；对T₀代草甘膦抗性植株PCR进行检测，发现因外源基因丢失或沉默，草甘膦抗性植株未必都含有目的基因，因此田间筛选应与PCR检测相结合；北京市农林科学院房山转基因基地转化验证结果发现3种导入方式其草甘膦抗性率和转化率高低顺序一致，均为CPPs介导>PEG介导>对照，与海南省三亚市崖城基地转化相同，且CPPs介导和PEG介导二者间差异极显著，京2416中二者相差0.26百分点，京92中相差0.36百分点。因此，在花粉管通道法转化玉米过程中加入介导物质有助于提高转化率，且加CPPs比加PEG更具有优势。     

PGM-35Sbar玉米通用表达载体的构建及玉米转化研究(英文)

[目的]构建玉米通用表达载体,以期为利用转基因手段提高玉米对非生物胁迫的耐受性奠定基础。[方法]通过对现有的pGreen0229植物表达载体进行改造,构建含有CaMv35S启动子驱动的抗草胺膦筛选基因bar、可用于连接目的基因的玉米表达载体PGM-35Sbar,并通过花粉管通道法转化吉444玉米自交系。[结果]PGM-35Sbar玉米通用载体构建成功,转化玉米植株后,得到抗性植株14棵,经PCR检测其中有12棵为阳性植株。[结论]该研究为快速构建含有特定目的基因的玉米表达载体奠定了基础。     

玉米ZmSKIP基因的克隆转化

随着淡水资源的匮乏,干旱已成为影响玉米产量众多因素中最主要的非生物因素。而植物的耐旱性又属于数量遗传性状,这给广大遗传育种工作者带来了一个很大的难题。SKIP基因属于RNA调控基因,它参与调节生物体内多种RNA的剪切调控,进一步调整植物状态,应对逆境环境。利用BLAST搜索玉米基因组,得到相似度99%的玉米基因,命名为ZmSKIP。对该基因克隆和生物信息学分析,构建过量表达载体,使用原位转化法得到过表达该基因的转基因株。对转基因株进行耐旱性实验,并使用ELISA方法检测转基因株的ABA含量。结果显示,转基因株中ABA相对野生型上升明显,具有更高的耐旱性。初步推断ZmSKIP在玉米中可能调控相应的耐旱基因表达从而调节植物对逆境的适应能力。     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

六种草坪地被植物耐旱性试验研究

利用隶属函数和动态聚类方法,综合分析6种草坪地被植物的耐旱性。结果表明,叶绿素(chl)、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)等5个生理生化指标在6种草坪地被植物间存在显著性差异。其中,金鸡菊和金盏菊叶绿素含量较高;百日草和天人菊脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性较高;金鸡菊和百日草丙二醛含量较低。通过隶属函数和动态聚类分析,初步将6种草坪地被植物的耐旱性划分为3类;胁迫前期,醉蝶花、金鸡菊和金盏菊表现为高耐旱性,百日草表现为中耐旱性,金鱼草和天人菊属低耐旱性;胁迫后期,百日草和天人菊表现为高耐旱性,金鱼草、金鸡菊和醉蝶花表现为中耐旱性,金盏菊属低耐旱性。     

CaCl2和GA3对盐胁迫下紫藤花粉萌发的影响

[目的]为探明缓解盐胁迫抑制紫藤花粉萌发的方法.[方法]采用花粉人工培养法,研究了不同浓度的CaCl2和GA3对盐胁迫下紫藤（Wisteria sinensis （Sims） Sweet）花粉萌发的影响.[结果]20 mmol/L NaCl胁迫对紫藤花粉活力和花粉管长度均显著降低（P＜0.01）,且花粉管出现分枝.1.5～ 12.0 mmol/L CaCl2和25 ～ 150 mmol/L GA3对盐胁迫下紫藤花粉萌发率和花粉管长均有一定的促进作用,而且均表现出随浓度的增加先增后降的趋势.[结论] CaCl2和GA3的最适处理浓度分别为2.0和100 mmol/L.     

运用差异显示技术分离水花生在干旱胁迫下表达上调的基因

干旱发生时,水花生的须根将转变成又长又粗的肉质根,这有利于保水和从土壤深处汲取水分以减轻旱害.本研究中采用差异显示技术克隆干旱发生时与水花生根形态发生相关的基因,为进一步通过转基因提高农作物抗旱性奠定基础;共使用15对引物组合,回收到20个可能的在干旱诱导后表达上调的带,其中有一个能被反向northern所证实;而后对其进行了克隆和测序;同源性比对表明它可能是一个新基因的片段.半定量RT-PCR分析进一步证明该基因在干旱和盐胁迫下表达上调.     

ZmDREB2.7正调控玉米耐旱性的功能分析

为评价 ZmDREB2.7优异等位基因型对玉米耐旱性的作用，选择携带优异等位基因型的玉米自交系CIMBL70、CIMBL92做父本及敏感基因型的玉米自交系SHEN5003做母本，用于构建近等基因系群体。结果表明，NIL- ZmDREB2.7CIMBL70和NIL- ZmDREB2.7CIMBL92恢复率分别为 94.96%和95.11%；苗期存活率分别是81.34%和83.33%，显著高于轮回亲本（SHEN5003，37.3%）。为更加明确 ZmDREB2.7的耐旱效应，构建了 ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7转基因玉米植株。转基因玉米材料 ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7-1和 ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7-10相对表达量更高，苗期存活率分别是68.05%和 70.83%，显著高于野生型（A188，58.33%）。在新疆大田干旱条件下， ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7-1和 ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7-10两个株系均比野生型小区少减产20%以上。因此，研究结果可能为玉米耐旱新品种的培育提供有价值基因资源和可行的实践方案。     

干旱胁迫与复水对玉米苗期渗透调节物质及抗氧化酶的影响

以掖单13号（抗旱性弱）和农大108（抗旱性强）为试材,采用盆栽控水的方法,研究了不同程度的干旱胁迫与复水条件对玉米苗期渗透调节物质及抗氧化酶的影响。结果表明,玉米苗期可溶性糖、蛋白质和脯氨酸的积累与品种的抗旱性呈负相关,抗旱性与水分胁迫下抗氧化酶类活性呈显著负相关,其中SOD和POD为主要抗氧化酶。     

梭梭HaNAC12转录因子抗逆功能验证

【目的】验证梭梭NAC转录因子基因（HaNAC12）的抗逆功能,以期解析梭梭响应逆境胁迫的分子机制,为梭梭及其他作物抗逆遗传改良提供理论参考。【方法】通过实时荧光定量PCR对HaNAC12基因在干旱、高盐、ABA处理下的表达模式分析。利用同源重组法、农杆菌介导喷花法、喷洒除草剂等方法构建并筛选HaNAC12转基因拟南芥...     

烟草高亲和钾转运蛋白基因NtHAK5克隆及表达模式分析

【目的】克隆烟草高亲和钾转运蛋白基因（NtHAK5）,并分析其在不同非生物胁迫下的表达模式,为深入探究该基因在烟草抵御低钾胁迫等非生物胁迫中的功能和作用机制提供理论参考。【方法】从普通烟草K326中扩增NtHAK5基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并构建pBWA (V) HS-NtHAK5-GLosgfp融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NtHAK5基因在不同组织和不同非生物胁迫条件下的表达特性,以无胁迫处理（正常供钾2 mmol/L K+）的植株为对照（CK）。【结果】烟草NtHAK5基因CDS序列全长2418 bp,共编码805个氨基酸残基,其编码蛋白的分子量为89874.00 Da,理论等电点（pI）为8.65,属于稳定性疏水蛋白,含有HAK家族蛋白典型的跨膜结构域。NtHAK5基因的二级结构中α-螺旋占40.12%,延伸链占24.97%,无规则卷曲占26.21%,β-折叠占8.70%。NtHAK5蛋白与烟草NtHAK1和黄花烟草NrHAK1蛋白的氨基酸相似性分别为40.69%和40.44%,与拟南芥AtHAK5相似性最高,为58.26%。NtHAK5基因启动子含有厌氧、低温、干旱、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）响应的相关顺式作用元件。NtHAK5蛋白定位在细胞膜上。低钾胁迫处理下和正常供钾（CK）条件下,NtHAK5基因在根、茎、老叶和新叶中均有表达,且均以老叶中相对表达量最高。NtHAK5基因在干旱胁迫、冷害处理、盐胁迫和低钾胁迫下的相对表达量显著高于CK （P<0.05）,但在低氮和低磷条件下的相对表达量与CK无显著差异（P>0.05）。【结论】 NtHAK5基因属于HAK基因家族成员,具有明显组织表达特异性,参与烟草植株对干旱胁迫、冷害胁迫、盐胁迫和低钾胁迫等非生物胁迫响应,推测其编码的蛋白在烟草组织中作为K+转运体参与非生物胁迫下K+的吸收、转运和再利用。