利用正交设计优化桃SRAP-PCR反应体系

以桃基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、Taq酶、dNTP、引物、模板5种因素4个水平对桃SRAP反应体系进行优化,建立了适合于桃的SRAP-PCR优化反应体系,该25μL反应体系:模板DNA50 ng,MgCl22.5 mmol/L,dNTP200μmol/L,上下引物各0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U,以灭菌双蒸水补齐至25μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环,72℃延伸10 min。     

大白菜SRAP反应体系的建立与优化

以大白菜基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mgz^2＋、Taq酶、dNTPs、引物、模板5种因素4个水平对大白菜SRAP（Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性）反应体系进行优化,建立了适合于大白菜的SRAP-PCR优化反应体系,该体系为25 μL：Mg^2＋浓度为3.0 mmol/L,dNTPs为0.2 mmol/L,Taq酶1.5 U,引物为0.2 μmol/L,模板DNA73.2 ng.PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,35 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环,72 ℃延伸10 min.     

基于毛细管电泳技术的牡丹SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

以牡丹叶片DNA为模板,对SRAP-PCR反应程序进行研究,确定适合的反应程序,即94℃预变性5 min;94℃变性1 min,33℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;随后94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;最后72℃延伸10 min。基于毛细管电泳技术,采用正交设计L18(37)对牡丹SRAP-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)3个水平进行了优化,构建了牡丹SRAP最佳反应体系:模板DNA 50 ng,dNTP 0.25 mmol/L,Mg2+浓度2.5 mmol/L,引物浓度0.4μmol/L,TaqDNA聚合酶0.5 U,总体积为25μL。各因素对扩增结果影响程度均不同:dNTPs>引物>DNA模板>Mg2+>Taq酶。运用该体系从756个SRAP引物组合中筛选出多态性好、条带清晰的26个引物组合,并证明了该体系稳定可靠。该体系的建立以及引物组合的确定为今后利用SRAP分子技术进行牡丹的相关研究奠定了科学基础。     

非洲菊SRAP标记的DNA模板制备及反应体系优化

为获得非洲菊清晰的SRAP标记图谱,对非洲菊DNA的提取方法及其SRAP-PCR反应体系的影响因子进行了初步探讨,建立了扩增多态性高、重复性好、带型清晰的DNA模板和SRAP-PCR反应体系.最佳SPAR-PCR反应体系:在50 μL的反应总体系中,Mg2 2.0 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,DNA模板100 ng,DNA聚合酶2.0 U,上游、下游引物各0.22 mmol/L.扩增程序:在94 ℃预变性4 min,反应前5个循环在94 ℃变性1 min,35 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min的条件下运行,随后的30个循环复性温度提高到55 ℃,最后72 ℃延伸5 min.     

均匀设计优化猕猴桃SRAP体系

采用均匀设计对影响猕猴桃SRAP-PCR体系的5种因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)进行5因素5水平和5因素3水平的两轮优化,建立猕猴桃SRAP-PCR的最佳体系(25μL):Mg2+2.50 mmol·L-1,dNTPs 0.25 mmol·L-1,引物0.2μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.25 U,模板DNA 150 ng.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,53℃复性1 min,72℃延伸1 min,33个循环,72℃延伸10 min.     

黄芪SRAP反应体系优化

以黄芪为材料,对黄芪SRAP反应体系进行优化.黄芪最佳SRAP反应体系为,在20 μl反应体积中含:模板DNA 15 ng,引物0.2 μmol/L,dNTP 200 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,Taq DNA聚合酶 1 U,1×Buffer;反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;最后72 ℃延伸5 min.     

胡椒ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子、双因子实验研究了胡椒ISSR-PCR反应体系中热参数和5个主要成分,即退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间以及Mg2+、dNTPS、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶对扩增结果的影响,建立了适合胡椒ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μL反应体系中,内含2 mmol/L Mg2+、200μmol/LdNTPS、1×PCR Buffer、2μmol/L引物、100 ng模板、1 U Taq DNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性3 min,94℃变性120 s,复性60 s,72℃延伸3 min,循环35个,结束后72℃延伸7 min。这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行胡椒种质鉴定、遗传多样性分析奠定了基础。     

白桦SRAP反应体系的建立与优化

以白桦(Betula platyphlla Suk)基因组DNA为模板,利用趋势面设计对白桦SRAP-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物P)在3个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了白桦SRAP-PCR反应的最佳体系。该反应体系为20μL:0.21g/LDNA,1.5μL;25mmol/LMg2+,1.4μL;5U/μLTaq酶,0.25μL;2.5mmol/L,2μL;10μm/L引物,0.35μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环,72℃延伸7min。     

西瓜SRAP-PCR程序和体系优化

建立适宜西瓜DNA的SRAP-PCR扩增体系,为西瓜基因图谱的构建和分子标记打下基础。以西瓜中华拳王品种为试验材料,探索了西瓜SRAP-PCR反应程序,并对西瓜SRAP-PCR反应体系的各影响因子进行梯度实验,筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳SRAP-PCR反应程序和体系。最佳SRAP-PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1min,共5个循环;94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。最佳SRAP-PCR反应体系(15μl)为:DNA 100 ng,dNTPs 0.3 mmol/L,Mg2+2.0 mmol/L,primer 7.5 pmol/L,Taq polymerase 0.75 U。该程序和体系能很好地满足西瓜基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于西瓜遗传研究是可行的。     

烟草RAPD反应体系的建立与优化研究

以烤烟品种为材料,研究了烟草RAPD分析过程中的影响因素,包括模板浓度、Mg2 、dNTP、引物、Taq酶、循环次数、退火温度等,建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系:即在25μl反应体系中,模板用量为40ng;引物浓度为0.4μM;Mg2 浓度为2.5mM;dNTP浓度为0.2mM;TaqDNA聚合酶用量为1U。扩增程序为94℃预变性5min;然后94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸1.5min,39个循环;最后72℃延伸5min。     

甜瓜SRAP-PCR程序和反应体系的优化

以甜瓜品种炮台红和皇后为试验材料,对影响甜瓜SRAP-PCR反应体系的各因子进行了梯度试验,并对退火温度进行了探索,得到扩增多态性高、重复性好、带型清晰的SRAP-PCR反应程序和体系。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,51℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。反应体系(共25μL):DNA 45 ng,Mg~2+2.0mmol/L,dNTPs0.15 mmoL/L,primer 0.24/μmol/L,Taq polymerase 1.5 U。结果表明,该程序和体系能够较好的满足甜瓜基因组SRAP扩增的要求。     

Establishment and Optimization of SRAP Amplification System in Lonicara caerulea L.

A single factor design was applied to optimize five factors influencing SRAP system, including Taq DNA polymerase, template DNA concentration, dNTPs, primer and Mg2＋, each at four levels. The optimal SRAP-PCR system for Lonicera caerulea L. was 20 ktL SRAP-PCR amplification reaction solution containing 2.0 μL 10×PCR buffer, 1.0 U Taq DNA polymerase, 30 ng template DNA, 0.2 mmol·L-1 dNTPs, 2.0 mmol·L-1 Mg2＋ and 0.2μmol·L-1 primer. The suitable amplification procedure consisted of an initial denaturation at 94℃ for 5 min; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 35℃ for 1 rain, extension at 72℃ for 90 s and in total five cycles; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 50℃ for 1 min, extension at 72℃ for 90 s and in total 35 cycles; extension at 72℃ for 8 rain; preservation at 4℃. The procedures and systems could meet the demand for SRAP amplification of Lonicera caerulea L. and would play an important role in Lonicera caerulea L. germplasm identification and genetic diversity analysis.     

香榧ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选

以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’基因组DNA为材料，对影响简单序列重复区间扩增?鄄聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的Taq酶用量、Mg²⁺浓度、模板DNA用量、磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和引物浓度等进行了优化试验。优化后的香榧ISSR-PCR扩增体系为：总容积20 μL，包括30 ng模板DNA，16.67 nkat Taq酶，0.350 μmol·L -1引物，1.625 mmol·L^-1 Mg²⁺，0.250 mmol·L^-1 dNTPs，10 × PCR buffer 2 μL。PCR扩增程序：94 ℃变性5.0 min；35个循环：94 ℃变性30 s，退火45 s，退火温度视引物而定，72 ℃延伸1.5 min；最后72 ℃延伸7.0 min，4 ℃保温。在此基础上，从77个ISSR引物中筛选出34个适合香榧ISSR分析的引物，且通过梯度PCR确定了各自最适的退火温度。研究结果为香榧遗传图谱构建打下了基础。图4表1参12     

南瓜SRAP反应体系的建立与优化

以‘密本’南瓜作为筛选体系的材料,通过单因素试验对南瓜20μL SRAP-PCR扩增体系的Mg^2＋、dNTP、 Taq酶、引物及DNA浓度和扩增程序的退火温度与循环次数进行优化,筛选出各组分的最佳浓度、最佳的退火温度和最佳循环次数。试验结果确立南瓜最佳的20μL SRAP体系为：0.2 mmol · L ^-1 dNTP ,1.5 U Taq酶,80 ng DNA ,0.16μmol·L^ -1的单条引物,Mg^2＋1.5 mmol·L^ -1,2μL 10＆#215;Buffer ;最佳扩增程序为：94℃预变性5min;94℃1 min ,35℃1 min ,72℃1 min ,5个循环;94℃1 min ,52℃1 min ,72℃1 min 35个循环;最后72℃延伸10 min。选用17个南瓜品种对确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、多态性丰富、特异性强、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于南瓜的SRAP分子标记。     

玉米大斑病菌RAPD分析最佳反应体系的建立

通过对玉米大斑病菌RAPD反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立了一套适合玉米大斑病菌的扩增反应体系及反应程序:25μL体系中,加入Taq DNA聚合酶2 0 U、25 mmol L的MgCl2 2 0 mmol L、dNTP 200μmol L、随机引物30 ng、10×PCR buffer 1μL、DNA模板30 ng、用重蒸水补足25μL。反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性1 min, 37℃退火1 min,72℃延伸2 min,40循环; 72℃延伸6 min。     

人参SRAP-PCR体系优化条件的建立（摘要）

[目的]研究人参基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系。[方法]采用单因子实验方法探讨模板DNA、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2＋浓度等因素对PCR结果的影响。[结果]优化后的扩增程序为：94℃预变性2min;94℃变性30s,48℃复性30s,72℃延伸1min,共40次循环;72℃延伸7min。最佳反应体系为：DNA模板30ng,上下游引物浓度2.0μmol/L,dNTP浓度0.3mmol/L,Mg^2＋2.5mmol/L,总体积25μl。[结论]建立了满足人参SRAP-PCR的优化扩增体系,为人参亲缘关系和遗传多样性SRAP分析提供快速、简便、重复性好的实验方法。     

小麦基因组SRAP扩增体系的初步研究

对影响SRAP扩增结果的各种因素包括DNA、引物、dNTPMixture、TaqDNA聚合酶的浓度及变性、复性、延伸的时间及温度进行了摸索。获得了能够稳定扩增小麦基因组的体系:20μL体系中DNA25ng,dNTP188mmol/L,TaqDNA聚合酶0 75U,引物25ng。扩增程序为:94℃1min,37℃1min,72℃10sec,5个循环;94℃1min,50℃1min,72℃10sec,35个循环;72℃1min。     

石榴ISSR-PCR反应体系的优化研究*

 以酸绿籽石榴为试材,对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行优化筛选。结果表明：25 μL　ISSR反应体系各组分的最适浓度分别为：1×buffer（不含Mg²⁺),1.5 mmol/L Mg²⁺,0.2 mmol/L dNTPs,TaqDNA聚合酶1.5 U,引物0.3 μmol/L,模板40ng。反应程序为：94 ℃预变性4 min,94 ℃变性45 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,40个循环,最后72 ℃延伸10 min。该体系的建立为从DNA分子水平进一步研究石榴种质资源遗传多样性、系统分类、品种鉴定奠定基础。     

黄藤ISSR反应体系的条件优化

在利用ISSR技术对黄藤进行分子生物学研究过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素,如模板DNA浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度以及退火温度等指标进行筛选和优化,获得用于黄藤ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:20μLPCR反应体积中含有1×缓冲液,20 ng模板DNA,2 mmol.L-1MgC l2,100μmol.L-1dNTP,1.5 U TaqDNA聚合酶,0.4μmol.L-1引物,2%甲酰胺,0.5 mmol.L-1亚精胺.扩增程序为:94℃预变性5 m in;再35个循环:94℃30 s,52℃45 s和72℃1.5 m in;最后72℃延伸7 m in.