黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

[目的]探讨黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性。[方法]通过离子交换层析和凝胶过滤层析,从黑眶蟾蜍皮肤中得到其白蛋白,命名为BufomA-skin。65nmol／L的BufomA-skin分别与30nmol／Ltrypsin在25℃不同保温时间（0．25—24h）下测定胰蛋白酶抑制活性,计算剩余酶活力。[结果]BufomA-skin为单链蛋白,分子量约为66．7kDa。但在非还原状态下,50～66kDa条带呈弥散样。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物的活性,但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。BufomA-skin与胰蛋白酶保温24h后,胰蛋白酶活性无恢复。[结论]黑眶蟾蜍皮肤白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用.     

黑眶蟾蜍血清白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,从黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)血清中得到其白蛋白,命名为Bu-fom-SA。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物活性的作用,但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。Bufom-SA对温度、pH及还原剂二硫苏糖醇的耐受性较强,3种因素对其胰蛋白酶抑制活性影响不大。黑眶蟾蜍血清白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,可能在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用。     

pH和盐度对黑眶蟾蜍变态期蝌蚪的影响

在正常盐度不同pH、正常pH不同盐度和相同水温23.2～25.7℃的条件下,研究pH和盐度对黑眶蟾蜍变态期蝌蚪的影响.结果表明,当pH为7.6～8.0时,盐度在4.0～7.0 g/L范围内对变态期蝌蚪96 h内存活率无明显影响(均在80％以上),盐度对变态期蝌蚪的24、48、72、96 h TLm值分别为8.99、8.25、7.99和7.64 g/L,安全浓度为2.17 g/L.在不同pH试验条件下,黑眶蟾蜍变态期蝌蚪适宜生存的pH为3.6～10.4,pH对变态期蝌蚪24、48、72、96 h TLm值分别为10.90、10.76、10.57和10.50,最低耐受限为3.21,最高耐受限为12.67.     

毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

为了发掘我国乡土树种毛白杨巯基蛋白酶抑制剂(CPI)基因资源,该研究在对已知植物巯基蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守性和杨树表达序列标签(EST)序列分析的基础上,设计了1对简并引物和1对杨树特异性CPI引物,应用RT-PCR技术在毛白杨形成层中扩增出了一个696 bp的cDNA片段,将此片段连接到pGEM-T Easy载体上并测序.结果表明,该片段含有一个417 bp的开放阅读框,编码138个氨基酸残基.进一步对氨基酸序列分析表明,该氨基酸具有典型植物巯基蛋白酶抑制剂的保守区段,即靠近氨基端具有甘氨酸（G）残基和［LVI］-［AGT］-［RKE］-［FY］-［AS］-［VI］-［EDQV］-［HYFQ］序列,羧基端具有与酶活性有关的QXVXG结构和PW残基,说明毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达.氨基酸序列同源性分析表明,该基因与其他林木CPI的同源性在47%～68%之间.      

烟田养殖黑眶蟾蜍对烟草农艺性状和病虫害发生的影响

明确烟田养殖黑眶蟾蜍对烟草农艺性状、烟田病虫危害的影响,探讨烟田引入黑眶蟾蜍后对烟草生长和烟田病虫害发生的规律,为烟田养殖黑眶蟾蜍的可行性提供理论依据。结果表明:养殖黑眶蟾蜍的烟田(处理),烟草农艺性状除了团棵期的株高、成熟期的节距和腰叶长外,其余的农艺性状指标均显著高于未养殖黑框蟾蜍的烟田(对照)。对照与处理烟田的斜纹夜蛾虫口密度分别为1.39只/m2和0.09只/m2,豆天蛾为0.41只/m2和0.09只/m2,二者的虫口密度对照烟田显著高于普通烟田。试验地烟草的病害较轻。可利用黑眶蟾蜍的捕食性建立生态烟田。     

日本蟾蜍皮肤claudin-4 cDNA的克隆与序列分析

为研究日本蟾蜍Bufo japonicus formosus皮肤中多肽类有效成分,通过菌落聚合酶链式反应（PCR）对日本蟾蜍皮肤cDNA质粒文库进行筛选,克隆到2条claudin-4全长cDNA序列（GenBank登录号为JX481975和JX481976）,并对它们进行生物信息学分析。日本蟾蜍claudin-4的2条cDNA全长分别为1 707 bp和1 697 bp,开放阅读框均为630 bp,其中虽有5个碱基不同,但编码的209个氨基酸完全相同。两者的5端非翻译区域序列长度不同,前者为50 bp,后者为41 bp,3端非翻译区域则分别为1 027 bp和1 026 bp。氨基酸序列同源性分析显示,日本蟾蜍claudin-4与非洲爪蟾Xenopus laevis的同源性最高,为88％,与其他7种动物的同源性介于65%~72%。克隆到2条日本蟾蜍claudin-4基因的cDNA序列,为今后研究日本蟾蜍Claudin-4 生物学功能奠定了基础。图5参21     

酸性水与碱性水中Mg2+浓度对黑眶蟾蜍蝌蚪存活率的影响

[目的]研究野外黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)蝌蚪的生存状况。[方法]研究分别在碱性水(p H 7.5~8.0)以及酸性水(p H 5.5~6.0)2种模拟环境条件下,通过急性毒性试验方法以不同的浓度梯度Mg~(2+)对黑眶蟾蜍蝌蚪进行24和48 h的胁迫试验。[结果]在相同浓度梯度和相同观察时间下,黑眶蟾蜍蝌蚪在碱性水中的存活率低于酸性水;不同p H的水环境与Mg~(2+)的协同作用显著影响黑眶蟾蜍蝌蚪的48 h存活率(F7,32=3.373,P0.05);黑眶蟾蜍蝌蚪在酸性水环境下适宜生存的Mg~(2+)浓度范围为1 418.41~1 590.54 mg/L,半致死浓度(LC_(50))为2 357.32 mg/L,安全浓度为521.51 mg/L;在碱性水环境下适宜生存的Mg~(2+)浓度范围为1 264.91~1 418.41 mg/L,LC_(50)为1 879.81 mg/L,安全浓度为533.99 mg/L。[结论]该研究可为今后黑眶蟾蜍的保护提供理论依据。     

野桑蚕中肠组织cDNA文库的构建及丝氨酸蛋白酶基因片段的克隆与序列分析

[目的]构建野桑蚕中肠组织cDNA文库并分离其丝氨酸蛋白酶基因。[方法]利用TaKaRa公司生产的cDNA Library Construction Kit构建了野桑蚕中肠组织的cDNA文库,并采用测序法克隆分析丝氨酸蛋白酶基因cDNA。[结果]经鉴定,文库的滴度达6.2×105pfu/ml,文库插入片段的平均大小为1.2 kb左右。从文库的测序结果中获得了野桑蚕丝氨酸蛋白酶基因片段(登录号:EU672968),序列分析结果显示:该基因片段由854个核苷酸组成,编码284个氨基酸残基。通过对该基因片段编码的氨基酸和其他10种昆虫的丝氨酸蛋白酶基因编码的氨基酸的同源性分析,发现该氨基酸序列与其他丝氨酸蛋白酶具有一定的同源性。[结论]该基因的发现对于研究家蚕和野桑蚕对外来入侵物的抗性具有重要意义。     

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的克隆及真核表达

利用PCR技术从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离得到1条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI,该基因cDNA编码区全长为1176 bp,可编码391个氨基酸。BlastP预测结果显示,该丝氨酸蛋白酶抑制剂属于SERPIN超家族。多序列比对结果表明,毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与已报道的胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高,相似性为92%,且蛋白的C端氨基酸序列都含有高度保守的反应中心环(RCL)。在此基础上,成功构建了PtrSPI基因的重组真核表达载体pPICK-PtrSPI并获得了重组毕赤酵母菌株GS115-PtrSPI。利用终质量分数为0.5%甲醇诱导重组真核蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在42648.45处出现了重组蛋白,与预期值一致。     

中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

采用兼并引物和RACE的技术,在中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis Jakovlev)中获得丝氨酸蛋白酶的全长c DNA序列,将该基因命名为ASJSP,c DNA全长为958 bp,开放阅读框为885 bp,推测编码295个氨基酸,预计分子量为31.20 k Da,等电点p I为9.38,预测分子式为C1 374H2 222N390O407S15,不稳定系数为31.94,总亲水性系数为0.114,为疏水性稳定蛋白质。序列分析表明ASJSP与其他盲蝽科昆虫已知丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列一致性为55.70%。     

比较中华大蟾蜍不同个体间galectin-3 cDNA分子多样性

从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)某一个体的皮肤第一链cDNA中克隆到多个编码半乳糖凝聚素3(Gal-3)的cDNA。为分析该现象在中华大蟾蜍中的普遍性,分离并纯化3个不同个体的皮肤总RNA并合成其第一链cDNA,然后以此为模板,通过DNA聚合酶链式反应(PCR)扩增gal-3的开放阅读框序列。序列分析结果表明,从3个不同个体中均克隆到多个不同的gal-3 cDNA的ORF,在3组不同的试验中,出现完全相同的克隆或者完全相同的缺失以及相同的多核苷酸多态性位点,支持gal-3 cDNA多样性的客观存在,揭示gal-3cDNA的多样性是该物种的特征。     

威宁中华蟾蜍的分子鉴定

为明确威宁中华蟾蜍的分子分类学地位,对采自贵州省威宁县的蟾蜍标本（标本号：LPSWN01A）进行线粒体12S rRNA 基因扩增和双重单系法分析。结果表明：该标本的序列大小为906 bp （GenBank 登录号：KJ803016）,基于数据集 A 构建的系统发育树中,威宁中华蟾蜍与7条中华蟾蜍同源序列聚为一个单系（中华蟾蜍支系）,威宁中华蟾蜍以较低的最大似然率独立为一个支系;基于数据集 B 构建的系统发育树中,威宁中华蟾蜍与2个中华蟾蜍华西亚种种群聚为一支,因此推断威宁产蟾蜍属于中华蟾蜍华西亚种（Bufo gararizans andrewsi ）。另外,威宁中华蟾蜍与云南怒江种群的遗传距离最近,为0．0093,说明威宁中华蟾蜍属于中华蟾蜍华西亚种,与之前的传统分类文献记载一致。     

二色补血草海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因的克隆及分析

以二色补血草叶片组织为材料构建了cDNA文库,文库的初始滴度为2.0×106pfu,重组率为95%,平均插入片段为0.8 kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu.mL-1。通过随机测序从文库中获得的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)基因的全长cDNA序列,该序列长1 986 bp,其中5’非翻译区163 bp,3’非翻译区680 bp,开放读码框长1 143 bp,编码380个氨基酸,蛋白分子质量为42KD,理论等电点为6.68。海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶在海藻糖合成过程中起关键作用,该基因的克隆为研究海藻糖在二色补血草中的合成奠定了基础。     

白色青年羊驼皮肤的基因表达分析

 【目的】研究羊驼皮肤功能发生的规律和机理以及发现新的功能基因。【方法】用SMART技术构建白色青年羊驼皮肤cDNA文库,随机挑取13 800个克隆进行规模测序。预处理后,获取高质量的表达序列。用CAP3对高质量序列进行拼接;BLAST对拼接序列进行同源比较,以注释功能;CLUSTER对已知序列进行聚类;根据标准基因词汇体系,并结合人组织基因表达谱分类标准,对具有注释信息的基因聚类进行分类,构建羊驼皮肤的基因表达谱。【结果】cDNA文库库容量达106PFU,从中获得高质量序列7 286条（在GenBank中命名为ASCD）。拼接成5 837条一致性序列,包括446条重叠群和5 391条单一序列。1 732条无相应注释,被认为是新基因。聚类成4 968个单基因簇（Unigene）。该基因表达谱最显著的特点是代表基本转录和翻译系统以及细胞骨架结构的转录本的表达丰度处于最高水平,原胶原I型（Procollagen typeI）等单个基因表达丰度处于较高水平。此外,还发现可能与羊驼毛质量、生长和毛色相关的基因。【结论】首次构建了羊驼皮肤cDNA文库和基因表达谱;获取的大量基因信息反映了青年期白色羊驼皮肤的生理特性和功能;该文库的构建是有效地发现新基因的理想资源。     

中国林蛙与中华大蟾蜍输卵管中甲状腺激素的比较

本文利用放射免疫分析方法测定了中国林蛙与中华大蟾蜍输卵管中的甲状腺激素(T_4与 T_3)含量,结果表明;林蛙输卵管 T_4与 T_3含量均高于蟾蜍输卵管,但后者此二种成分含量也很可观,故对其有开发利用的价值。     

野生大豆种子cDNA文库构建及其球蛋白基因克隆

以优质野生大豆(Glycine soja)的近成熟种子为材料成功构建了野生大豆cDNA文库,库容量为9.594×105克隆,文库的重组率约为93.7%。PCR检测重组克隆的插入片段平均大于1 000bp,表明构建的近成熟种子cDNA文库质量较高。从文库中随机挑选252个克隆进行3′端测序,得到217条表达序列标签(EST),测序结果表明,片断大于500bp;野生大豆与栽培大豆(Glycine max)球蛋白的cDNA序列存在99%相似性。     

大麦HvRBR基因克隆与序列分析#br#

【目的】从栽培大麦（Hordeum vulgare）中分离并克隆对植物细胞周期起负调控作用的RBR（retinoblastoma-related）,鉴定大麦RBR（HvRBR）分子特征,明确其与同源基因间的亲缘关系和分类地位,为探索动、植物生长发育过程中细胞增殖和分化相关调控途径的研究提供理论依据。【方法】通过对植物RBR生物信息学分析,根据RBR保守区域序列设计通用引物,采用PCR方法从栽培大麦DNA和苗期总cDNA中分别分段克隆,获得特征序列后在DNAMAN软件下进行序列分析、多重序列比对并构建系统树。【结果】从栽培大麦籽粒皱缩突变材料GSHO1854中获得全长为5 547 bp的大麦HvRBR序列（GU121481）,其cDNA编码区（GU121480）全长3 179 bp,包含一个编码975个氨基酸的开放阅读框。由其推导的氨基酸序列与已报道的RBR蛋白序列有较高的一致性。在A、B保守区之间有一个间隔区,虽然同源性较低,但是所有氨基酸序列的相似位点都包含一个半胱氨酸残基,这说明该半胱氨酸残基形成的分子内或分子间二硫键可能对整个RBR蛋白的结构和功能产生重要的影响。系统进化分析表明HvRBR与水稻同源性最高（84.3%）,与苜蓿、拟南芥等双子叶植物的同源性较低（50%）。【结论】首次从大麦中得到与植物细胞周期起调控、细胞增殖和分化相关的RBR蛋白编码基因HvRBR。对栽培大麦籽粒皱缩突变材料GSHO1854的HvRBR进行了分子克隆和鉴定,并通过系统进化分析将HvRBR归为植物RBR家族C亚族。