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【目的】建立生防菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)gCLA4的遗传转化体系,为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因标记的整合型质粒pSET152为出发质粒,Escherichia coli ET12567(pUZ8002,pSET152)为供体,淡紫灰链霉菌gCLA4为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基、热激温度、接合转移时间和筛选转化子培养基等因素进行优化。【结果】成功地将质粒pSET152转入到了生防链霉菌gCLA4中,明确了可用于筛选链霉菌gCLA4转化子的抗生素为安普霉素或四环素;链霉菌gCLA4孢子50℃热激时转化效率较高,接合效率在16,18,20h下没有明显差异,MS培养基作为接合转移培养基时转化效率最高,接合产物涂布到高氏一号抗性培养基上进行阳性转化子筛选的效果最好。【结论】建立了生防链霉菌gCLA4的遗传转化优化体系。 相似文献
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溶磷草酸青霉菌筛选及其溶磷效果的初步研究 总被引:53,自引:0,他引:53
采集石灰性土壤样品进行了溶磷微生物的筛选 ,获得了具有溶磷作用的草酸青霉菌菌株P8和Pn1。不同培养条件下测定了它们的溶磷能力 ,并与拜莱青霉菌ATCC2 0 85 1和解磷巨大芽孢杆菌ATCC14 5 81进行了比较。在固体培养基上草酸青霉菌P8、Pn1表现较强的溶解Ca3 (PO4) 2 、Ca8H2 (PO4) 65H2 O、CaHPO4、FePO4和骨粉的能力 ;在液体培养条件下 ,能有效的溶解摩洛哥磷矿粉 ,氮源对其溶磷效果有显著影响 ,硝态氮高于铵态氮 ;接种P8能够显著增加灭菌和不灭菌土壤的有效磷含量 ,灭菌土壤增加的有效磷略高于不灭菌土壤。氮源影响草酸青霉菌产生有机酸的种类 ,使用铵态氮时主要分泌苹果酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、琥珀酸 ,而硝态氮条件下几乎不再产生这些有机酸。这表明 ,氮源形态影响了它的代谢方向 ,而且它的溶磷机理不只一种 ,其机理尚不清楚 ,有待研究 相似文献
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吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选 总被引:1,自引:1,他引:0
【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,其初级库容量约为1.0×106 PFU,扩增文库的滴度为8.2×108 PFU?ml-1,文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析,共获得30个新基因,其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原,以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。 相似文献
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大豆根际溶磷菌分离鉴定及溶磷过程中有机酸的分泌 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】明确吉林省地区大豆Glycine max根际溶磷菌的种类及溶磷特点。【方法】利用溶磷圈法筛选溶磷菌,16S rDNA序列测定和Vitek2生理生化系统对菌株进行分析鉴定。测定菌株生长量、溶磷量、培养基pH变化与有机酸的产生。【结果】从大豆根际土壤中分离获得4株溶磷菌株WJ1、WJ3、WJ5和WJ6。4个菌株分别属于假单胞菌属Pseudomonas sp.、肠杆菌属Enterobacter sp.、苍白杆菌属Ochrobacterum sp.和克雷伯菌属Klebsiella sp.。4株溶磷菌96 h内最大溶磷量分别为558、478、596和586μg·m L-1。甲基红试验和培养物p H测定结果表明:4个菌株在溶磷过程中可使培养物的pH下降,当p H小于4时,会明显阻碍菌株的生长。p H为5时,WJ1和WJ3的生长受到轻微的影响,WJ5和WJ6能正常生长。GC-MS对菌株在溶磷过程中产生的有机化合物的分析表明,4菌株均分泌多种有机酸,其中α-酮戊二酸在WJ1、WJ3和WJ6菌株溶磷过程中大量产生。【结论】4菌株具有较好的溶磷能力,溶磷过程中分泌有机酸种类不完全相同,有机酸的分泌造成培养基的p H降低,影响菌体生长,而菌体数量决定各菌株的溶磷量。 相似文献
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【目的】芍药具有极佳的观赏价值,但其种子的双重休眠难以解除,严重阻碍芍药的育种进程。本研究利用gateway技术构建芍药种子休眠解除关键时期的酵母杂交cDNA文库,可用于筛选调控芍药种子休眠解除相关基因的转录因子及互作蛋白。本文库的构建可为丰富芍药种子休眠调控研究提供科学支撑,能为芍药栽培育种和野生资源保护及利用奠定分子理论基础。【方法】本研究以休眠解除过程中5个关键时期的芍药种子为试验材料,进行总RNA的提取和m RNA的分离,使用gateway方法构建cDNA初级文库,再通过LR重组,将初级文库重组到pGADT7-DEST次级文库载体上,构建出次级文库,最后经过酵母转化试验,将次级文库质粒转化到酵母Y187感受态细胞中,构建出芍药种子休眠解除过程的酵母文库。【结果】经鉴定,cDNA初级文库库容量为1.28×107 CFU,平均插入片段长度在1 000 bp以上,重组率为100%;cDNA次级文库库容量为1.12×107 CFU,平均插入片段长度在1 000 bp以上,重组率为100%;酵母文库滴度为7.0×107 CFU/mL,平均插入片段长度在1 000 bp以上,重组率为96%... 相似文献
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琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。 相似文献
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【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签(EST),序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。 相似文献
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【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白(Ufm1)的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufm1基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufm1基因,经全长cDNA文库筛选获得Ufm1基因全长序列。【结果】Ufm1基因全长cDNA序列长714 bp,包含261 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9.3 ku,等电点pI为6.55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufm1基因存在较高的同源性。【结论】Ufm1基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufm1基因功能及原核表达等奠定了基础。 相似文献
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【目的】通过构建冬瓜酵母双杂交cDNA文库,为开展冬瓜基因功能研究提供技术支撑。【方法】以冬瓜高代自交系B227(冬瓜参考基因组测序材料)的根、茎、叶、雄花、嫩果等不同组织为材料,利用CTAB法提取RNA、分离纯化获得mRNA并进行双链cDNA合成和DSN均一化处理后,与pDONR222载体进行BP重组反应,转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建初级文库;提取初级文库质粒,与pGADT7-DEST载体通过LR重组反应,转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建酵母杂交cDNA次级文库。利用倍比稀释法计算文库库容量,并通过菌落PCR计算文库重组率和插入片段的大小。【结果】初级文库库容量为8.24×106 CFU,冬瓜均一化酵母双杂交次级cDNA文库库容量为1.03×107 CFU;次级文库中插入片段主要集中在850~3 000 bp,重组率为100%,具有良好的多态性。【结论】成功构建了冬瓜均一化酵母双杂交cDNA文库,文库完整性较高、质量较好,符合酵母双杂交实验要求,可应用于后续相关基因产物互作蛋白的筛选等试验,为冬瓜基因功能研究提供前提条件。 相似文献
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利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统(split-ubiquitin yeast membrane system),以小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)的外壳蛋白(CP)基因为诱饵对异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)cDNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds cDNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到pPR3-N文库载体上,构建得到以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选pPR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology(GO)注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×106 cfu,文库实际扩增数量大于1.3×106 cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉cDNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库,这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库的成功构建与筛选,为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。 相似文献
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木霉菌REMI转化子解磷筛选及其解磷效果分析 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]为了获得具有防病和解磷双重功能的木霉菌REMI转化子。[方法]从康氏木霉菌(Trichoderma koningii)T30及其60株REMI(限制性内切酶介导的基因整合技术)转化子中筛选出3株解磷作用较好的转化子,并研究不同碳、氮源对转化子TK!46解磷作用的影响。[结果]结果表明,碳源对转化子解磷能力影响较小,而氮源的作用较大,其中转化子在解磷过程中最适氮源是氨态氮。[结论]该研究为研制多功能木霉剂奠定了基础,但完全揭示木霉菌解磷机理仍需进一步研究。 相似文献
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一株溶磷抑病细菌的筛选及其溶磷特性 总被引:2,自引:0,他引:2
【目的】筛选一株兼具高效利用Ca3(PO4)2、磷矿粉和卵磷脂等难溶性磷源和抑制土传病害功能的菌株。【方法】液体培养条件下测定所筛菌株对Ca3(PO4)2、磷矿粉和卵磷脂的溶磷效果,平板对峙试验研究对土传病害的拮抗作用。【结果】通过室内平板和摇瓶试验,从江苏和安徽的5种石灰性土壤中分离、筛选获得的6株溶磷菌,均能溶解Ca3(PO4)2、磷矿粉和卵磷脂。其中,菌株P1溶解Ca3(PO4)2和卵磷脂的效果最好,培养7d后水溶性磷浓度分别达到674.5和33.0μg·mL-1,其对磷矿粉的溶磷量也达132.3μg·mL-1。经过16SrDNA基因序列分析和生理生化鉴定,菌株P1为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。对峙试验结果表明,其对辣椒疫霉、大丽轮枝菌、烟草疫霉烟草变种和立枯丝核菌都有一定的拮抗作用。【结论】菌株P1不仅对Ca3(PO4)2、磷矿粉和卵磷脂有较好的溶解效果,对一些土传病害病原菌也有抑制作用。 相似文献
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【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌 SD-2a(Oenococcus oeni SD-2a)的苹果酸-乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE检测及斑点杂交检测,并对酵母转化子培养上清液进行L-苹果酸及L-乳酸含量的HPLC分析,检测目的基因的功能性表达。【结果】转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定表明获得了阳性转化子;SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了目标蛋白,斑点杂交检测表明目的基因整合到受体菌中。模拟发酵表明mleA基因整合到受体菌中后进行了功能性表达,将培养基中的L-苹果酸转化成L-乳酸,使得培养液中的L-苹果酸含量极显著降低。转化子YS59/pYILmleA在添加5 648 mg?L-1 L-苹果酸和10%葡萄糖的SD/-Ura培养基中培养4 d,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量与空载体转化子YS59/YIp5(对照)差异极显著,苹果酸的相对降低率为20.18%~20.85%。供试的转化子L-乳酸生成量为1 278~1 312 mg?L-1,对照未检出乳酸的生成。【结论】中国自主筛选的专利菌种O.oeni SD-2a的mleA基因的整合型表达质粒构建成功并在酿酒酵母中进行了功能性表达。 相似文献
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【目的】草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)是侵染草莓的主要病毒,但其侵染草莓的机制尚不清楚。论文以SVBV的P6蛋白为诱饵筛选森林草莓(Fragaria vesca)c DNA文库的寄主因子,为解析SVBV侵染草莓的分子机制提供理论依据。【方法】SVBV接种森林草莓,提取出现明显症状叶片的总RNA,Dnase I处理后,用SMART法反转录合成ds c DNA,均一化处理c DNA并酶切纯化,将400 bp的短片段去除,其余片段连接到p GAD-T7质粒载体上,构建森林草莓初级c DNA文库。同时将SVBV P6构建到酵母双杂交诱饵载体p GBK-T7上,再将p GBK-P6和p GBK-T7分别转化酵母菌株AH109,阳性酵母菌株接种SD/-Trp液体培养基,鉴定诱饵载体对酵母细胞的毒性。将转化p GBK-P6的酵母菌分别涂布SD/-Trp、SD/-Leu-Trp和SD/-His-Trp平板,测定菌落生长情况,分析P6蛋白对酵母报告基因的自激活活性。然后用森林草莓初级c DNA文库质粒转化含有诱饵载体p GBK-P6的AH109酵母菌株,共转化子依次涂布SD/-Leu-Trp、SD/-Leu-Trp-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal平板,最终筛选蓝色且长势较好的阳性菌落,提取酵母质粒并测序,Gen Bank中初步比对候选基因,利用Uniprot在线网站的gene ontology(GO)通路注释互作蛋白因子,分析互作蛋白的生物学功能。【结果】3种c DNA文库平均库容超过2.0×106 cfu,平均文库重组率为97%,文库插入片段平均扩增长度1 kb,表明森林草莓c DNA文库符合试验标准。最终利用SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal培养基筛选得到230个酵母阳性克隆,经过序列相似性比对,除去重复序列、载体序列和移码序列,共筛得15个与SVBV P6互作的寄主因子。GO通路注释结果表明这些寄主因子参与了13种生物过程,包括泛素化、转录因子调节、防御反应、代谢过程、氧化还原和胞内氨基酸代谢等过程;这15个寄主因子的分子功能多样,包括乙酰转移酶活性、萜烯合酶活性、脱氢酶活性、金属离子结合活性、蛋白激酶活性和水解酶活性等。【结论】成功构建了森林草莓酵母c DNA文库,筛选出15个与SVBV P6互作的森林草莓寄主因子,为进一步探明SVBV与森林草莓互作的分子机理提供了理论依据。 相似文献
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【目的】筛选与FWL1互作的蛋白,为研究FWL1基因调节果实大小机理提供依据。【方法】以杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香为材料,提取4个梨品种果实细胞分裂关键时期的果肉组织混样RNA。构建梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库,并鉴定文库质量。构建诱饵载体并转化酵母菌,筛选与FWL1互作的蛋白,对初步筛选出的阳性酵母克隆进行测序并在NCBI中进行Blast比对,确定候选互作蛋白。【结果】文库库容约为3×107 CFU,大于1×107 CFU,平均插入片段大于1 000 bp,阳性率为≥98%。诱饵载体无自激活功能,利用共转化方法,筛选出272个与FWL1互作的蛋白质。【结论】梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA文库符合酵母双杂文库的基本条件,适用于后期筛选相互作用的蛋白。筛选出的272个互作蛋白在果实发育过程中表达不同,其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1和metallothionein-like protein可能与梨果实大小发育有关。 相似文献
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亚洲棉(Gossypium arboreum L.)全生育期均一化全长cDNA文库的构建和鉴定 总被引:5,自引:0,他引:5
【目的】构建二倍体亚洲棉石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库,建立亚洲棉功能基因组学研究基础平台,发掘亚洲棉发育、抗逆等相关基因。【方法】取石系亚1号子叶期、苗期、蕾期、花铃期不同组织器官,提取总RNA并分离纯化mRNA,采用SMART技术反转录全长双链cDNA。用DSN(duplex-specific nuclease)法对全长双链cDNA进行均一化,均一化的cDNA连接到λZAPⅡ载体,包装蛋白包装后构建石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库。【结果】初级文库滴度4×106 pfu?ml-1,库容2×106个独立克隆,重组率大于95%,插入片段平均长度大于1.5 kb。随机挑取192个克隆进行EST(expressed sequence tags)测序,冗余度仅为3.49%。BLASTN比对结果显示:78.31%的EST为新EST。【结论】文库均一化效果良好,质量符合要求,可能包含大量新基因,是进行EST测序、发掘新基因等棉花功能基因组学的研究平台。 相似文献
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【目的】通过农杆菌介导的遗传转化(ATMT)方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量(试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度)试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为:农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25 ℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化,转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。 相似文献