牛肌肉生长抑制素基因敲除打靶载体的构建

【目的】构建两套用于牛肌肉生长抑制素（myostation,MSTN）基因敲除的置换型打靶载体。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）以牛耳皮肤组织基因组DNA为模板分别扩增出两套打靶载体的同源短臂和长臂,再分别插入到两套打靶专用基础载体pMCS-PLP和PⅢ中,构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。【结果】经过PCR、T载体连接和DNA测序,证实载体pPLP-MSTN包含2.8 kb同源短臂和4.0 kb同源长臂,载体PⅢ-MSTN包含1.3 kb同源短臂和6.8 kb同源长臂;经过限制性内切酶酶切鉴定,证实两套载体的同源臂分别正确插入到基础载体内。【结论】两套牛MSTN基因敲除打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN构建成功,载体pPLP-MSTN为不含负筛选标记的传统基因敲除打靶载体,载体PⅢ-MSTN为不含负筛选标记的荧光蛋白启动子捕获打靶载体。     

同源重组敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞的构建

 【目的】获得敲除肌肉生长抑制素（MSTN）基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建：以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5 382 bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844 bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35 d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250 μg?ml-1 G418筛选7 d,再用200 μg?ml-1 G418+2μmol?L-1 GANC维持筛选。用RT-PCR法检测转染前转染后细胞MSTN基因表达量。【结果】成功构建了对猪MSTN基因部分intron2和exon3区域进行敲除的替代型打靶载体。共得到5个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中一个细胞克隆发生了正确的同源重组。转染后细胞MSTN基因表达量明显降低。【结论】获得了敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞。     

猪MSTN基因敲除载体的构建

MSTN基因在成年动物所有骨骼肌中都可检测到表达,其突变或缺失会导致肌肉量的增加。根据已知的MSTN序列设计引物,通过PCR的方法获得了同源臂序列,同源长臂5 382 bp,包括全部的外显子1、2,同源短臂844 bp,包括部分外显子3,在含有正负筛选标记基因的载体上插入上述2个同源臂,构建完成了替代型猪MSTN基因敲除的打靶载体——ploxpⅡ-MSTN,为后续获得MSTN基因缺失型细胞株奠定了试验基础。     

利用CRISPR/Cas9技术构建猪的LDLR基因敲除细胞

利用CRISPR/Cas9系统构建猪的低密度脂蛋白受体基因LDLR敲除细胞：根据NCBI数据库猪LDLR基因(Gene ID为396801)序列设计sg RNA靶位点，构建敲除打靶载体，通过电转染猪胎儿成纤维细胞，经G418筛选获得细胞克隆，进行PCR扩增和T载体克隆测序，经序列比对计算基因敲除效率。结果表明，依照CRISPR/Cas9系统GN20GG法则，在LDLR基因第一外显子上设计1条sg RNA，测序结果显示靶序列已正确连接，转染、筛选后共获得30个单细胞克隆，23个测序成功，其中有7个细胞克隆为LDLR基因敲除细胞克隆，敲除效率为30.4%。     

猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验

【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。     

猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素（Myostatin,MSTN）基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9 kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞（PK15细胞）,用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14 kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。     

AAV-SaCas9敲除MSTN基因病毒的构建及鉴定

为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-293细胞3 d后,分离纯化病毒并用实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。结果显示,成功构建了敲除MSTN基因的AAV-SaCas9重组载体,T7酶切和测序鉴定出sgRNA2位点可以对MSTN进行编辑,并成功将其包装成病毒,经荧光定量PCR鉴定病毒滴度为2.73×10~(12)vg/mL。     

牛肌肉抑制素前肽对牛肌卫星细胞增殖的影响

通过PCR扩增目的基因,构建真核表达载体,利用PEI转染牛肌卫星细胞,转染后48与72 h通过CCK-8与流式细胞术检测细胞增殖的变化,通过RT-PCR检测目的基因的表达,通过RT-PCR与Western blot检测下游基因P21,CDK2的表达变化.结果表明,在两个时间点,实验组细胞活力明显升高(P<0.01),G0/G1期细胞所占的比例明显下降(P<0.01),S期细胞所占比例明显上升(P<0.01),MSTN前肽基因有大量表达,P21表达下降,CDK2表达上升.结果揭示,在牛肌卫星细胞中,MSTN前肽通过下调P21,上调CDK2的表达量促进细胞增殖.旨在揭示牛MSTN前肽基因对牛肌卫星细胞(MDSC)增殖的影响,为后续的转基因牛试验提供理论依据.     

峨边花牛肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及序列分析

[目的]为改良峨边花牛地方品种、提高产肉率及种质资源的保存奠定基础和提供技术依据。[方法]以从乐山峨边花牛骨骼肌中提取总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得肌肉生长抑制素基因(MSTN)cDNA片段,将其克隆到T载体上,通过PCR鉴定阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增,得到峨边花牛MSTN基因cDNA的全序列,全长1 135 bp,包含全部的MSTN编码序列,共有3个外显子。将峨边花牛MSTN基因在GenBank上与比利时双肌牛及皮埃蒙特双肌牛比较后发现,峨边花牛在上述2种品种双肌牛的突变位点碱基未发现异常。[结论]成功地克隆峨边花牛的MSTN基因并对其进行测序对于后期表达载体的构建奠定了基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术介导SST基因敲除细胞的制备

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了SST基因敲除的细胞。在猪SST基因第一外显子区域设计2个向导RNA (sgRNA),用PX459构建成表达质粒,电转染猪胎儿的成纤维细胞,在48 h后用嘌呤霉素筛选细胞。通过PCR扩增、测序检测,在获得的13个克隆中,有2株细胞未检测到基因敲除,4株细胞发生单等位基因敲除,7株细胞为双等位基因删除。筛选到的纯合子单克隆细胞可用于制备SST基因删除猪。     

Effect of MSTN Propeptide and shRNA Co-expression Vector on Proliferation of Skeletal Muscle Satellite Cells

Myostatin(MSTN)is a negative regulator of skeletal muscle growth,in order to study the effect of inhibition MSTN expression on the proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells,we constructed co-expression vector pcDNA3.1-ProMSTNshRNA,transfected it into muscle satellite cells by Liposome 2000,and detected cell proliferation changes by CCK-8 method and flow cytometry after 48 h.The expressions of P21 and CDK2 were detected by Western blot and real-time PCR.The results showed that the cell vitality of experimental groups significantly increased than that of the negative control,and cells in S phase also increased significantly(P<0.05).After knocked down MSTN gene,P21 expression decreased(P<0.05),but CDK2 gene expression increased(P<0.05).These results indicated that MSTN gene expression was associated with P21 and CDK2,the proliferation of skeletal muscle satellite cells could be promoted while MSTN was inhibited,which provided a theoretical basis for the study on transgenic cattle.     

绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用

【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。     

一种新的番鸭MSTN基因转录本的克隆及真核表达

    利用RT-PCR扩增 MSTN cDNA全序列,然后进行克隆、测序;将重组质粒 pEGFP-N1-MSTN-2通过脂质体瞬时转染番鸭成纤维细胞,用RT-PCR和SDS-PAGE检测其蛋白表达.结果表明,番鸭体内存在2种MSTN基因转录本,MSTN-1(EU336991)和MSTN-2(EU336992),大小分别为1128 bp和754 bp,同源性为94%;且MSTN-2是一个全新的MSTN转录本,含有1个开放阅读框,可编码124个氨基酸.将pEGFP-N1-MSTN-2转染番鸭成纤维细胞48 h后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白表达,蛋白大小约为14 kDa.这对于进一步研究MSTN基因功能及作用机理具有重要意义.     

大耳白兔MSTN基因SNPs位点筛查及生物信息学分析

为探明大耳白兔MSTN基因与生长发育及肉质性状的关联性,以大耳白兔为试验对象,构建DNA混合池,采用PCR扩增和直接测序技术对该基因进行单核苷酸多态性(SNP)筛查,从而筛选出对大耳白兔肉质性状有显著影响的SNP位点,利用生物信息学方法从分子水平对大耳白兔MSTN基因编码的蛋白质进行功能预测和同源性分析。结果显示:大耳白兔MSTN基因编码区序列全长1 128 bp,编码375个氨基酸,是一种不稳定的水溶性蛋白;蛋白质分子量42.8 ku,理论等电点为6.97;蛋白质二、三级结构均为混合型,无规则卷曲所占比例最高。在扩增区域的非编码区发现1个SNP位点,该突变不影响编码氨基酸的改变。同源性分析表明,大耳白兔MSTN基因与普通家兔相似度为100%,与家猫相似度较高,亲缘关系很近。     

朗德鹅肌肉生成抑制因子基因（MSTN）的克隆及其表达量与日粮能量、血清IGF-I和GH的关系

 【目的】采用反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）技术，克隆朗德鹅肌肉生成抑制因子基因（MSTN），研究MSTN基因表达和日粮能量及其部分血清激素含量的相互关系，了解MSTN的功能，为水禽分子营养和分子育种提供基础资料。【方法】从朗德鹅（Anser anser）的腿肌中抽提总RNA，用两步法RT-PCR扩增出MSTN基因的cDNA编码序列，以pGEM-T Vector为载体，将该片段克隆到大肠杆菌（Escherichia coli）中。通过筛选阳性克隆，双酶切鉴定后测序；以MSTN基因的克隆为基础，以β-actin为内标，构建优化的半定量RT-PCR方法，研究高中低（A:13.38MJ•kg-1、B:12.13MJ•kg-1、C:10.87MJ•kg-1）3种不同能量对朗德鹅21日龄和70日龄2个时期,肌肉组织MSTN基因表达的差异；同时用放免法测定21、70日龄的血清GH和IGF-I浓度。【结果】克隆朗德鹅MSTN基因cDNA的部分序列，其片段大小为1 128bp，编码375个氨基酸组成的多肽，与已发表的鸡、鸭、鹅的MSTN 核苷酸相似性分别为94%、94%、99%；氨基酸的相似性分别为98%、97%、98%；21日龄时，朗德鹅公鹅、母鹅MSTN表达量差异不显著；70日龄时朗德鹅公鹅MSTN的表达量情况为能量A＞C＞B，朗德鹅母鹅MSTN的表达量情况为C＞B＞A；对于朗德鹅21～70日龄阶段的生长，MSTN基因的表达量和血清IGF-I的变化基本一致；与血清GH含量之间并不存在很大关联，GH和能量的高低呈正相关。【结论】日粮能量对21日龄后朗德鹅MSTN基因的表达有影响，且MSTN基因表达量和血清IGF-I具有相关性，和血清GH无较大相关性。