角蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及其产酶条件优化

为进一步扩大角蛋白酶高产菌株的来源及提高其产酶能力,采用羽毛粉为惟一碳、氮源平板培养基,对从广西几大原始森林和自然保护区的土壤中得到能够降解羽毛角蛋白的菌株进行了筛选、鉴定及其产酶条件优化。结果表明：共分离出15株可有效降解角蛋白的菌株,其中,银滩3＃、天坑1＃、天坑3＃、天坑4＃、天坑5＃和大明山3＃菌株在羽毛培养基上的菌丝长势较好,且菌丝圈直径超过5 cm,经对3株（银滩3＃、天坑3＃和大明山3＃）在羽毛培养基平板上的菌丝生长圈最大的菌株进行复筛,天坑3＃为对羽毛蛋白降解效果最好的菌株;通过对该菌株形态特征观察,初步认定其为木霉属（Trichoderma）。经优化,碳氮源分别以20 g／L 葡萄糖和40 g／L 蛋白胨为宜,该菌株在此条件下摇瓶震荡培养第4天,以羽毛粉为底物时其角蛋白酶酶活高达34．20 U／mL。     

豆豉芽孢杆菌原生质体形成及再生条件的初步研究

为选育出适宜于工业生产豆豉的重组菌株,对4株豆豉芽孢杆菌原生质体形成与再生条件进行了初步研究。结果表明:溶菌酶浓度、酶解时间和温度与原生质体的形成率成正相关,与再生率成负相关。不同菌株对溶菌酶的敏感度不同,适宜形成原生质体的酶浓度为0.05~0.50 mg/mL,酶解时间5~20 min,酶解温度35℃,原生质体形成率达90%,原生质体再生率为8%左右。     

基于基因组改组技术的角蛋白酶高产菌株选育研究

【目的】筛选具有高效角蛋白水解活性的微生物,为提高废弃羽毛中角蛋白资源的利用奠定基础。【方法】采用梯度稀释法,以羽毛作为惟一碳氮源对土样中的产角蛋白酶菌株进行筛选,筛选可高效降解羽毛的细菌。通过菌株的形态、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,对菌株进行分类鉴定,并探讨其最适发酵条件。利用硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)对目的菌株进行诱变,确定最适诱变条件,并进行原生质体融合,通过基因组改组选育角蛋白酶高产菌株。【结果】分离筛选到1株具有较强羽毛降解能力的菌株ZJT01,该菌落圆形凸出,革兰氏染色呈阳性,酪素水解、硝酸盐利用、柠檬酸利用等生理生化试验均呈阳性。结合菌株16S rDNA同源序列比对分析,初步鉴定其为节杆菌(Arthrobactersp.)。菌株ZJT01产角蛋白酶的最适发酵温度和时间分别为32℃和72h。其DES最适用量为9μL/mL,诱变时间为20min;NTG的最适合质量浓度是0.6mg/mL,处理时间为15min。原生质体制备的最佳条件为:溶菌酶终质量浓度10 mg/mL,酶解温度37℃,酶解0.5h。经过硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)分别诱变处理,获得角蛋白酶活性提高的菌株DES-2和NTG-2;对其进行3轮基因组改组后,筛选到2株角蛋白酶活性比亲本菌株ZJT01提高了5.48倍的重组菌株,且其产酶活性可稳定遗传。【结论】通过基因组改组技术获得了2株角蛋白酶活性大幅提高的菌株F3-5和F3-6,这2株菌对羽毛的降解效果较亲本菌株ZJT01明显提高,具有较好的应用前景。     

拟青霉菌株Z-1降解羽毛角蛋白特性的研究

从某养殖场污水处理系统中分离到一株能够降解羽毛角蛋白的真菌,经鉴定,暂定为拟青霉属(Paeciliomyces)菌株Z-1.菌株Z-1是一种好氧菌,供氧充足有利于它将羽毛角蛋白转化为可溶性蛋白.在分批培养中,最适初始pH值为9,最适温度30℃,钙离子和镁离子对其酶活性有促进作用.在菌株Z-1的酶解作用下,6 d后羽毛角蛋白分解率高达91.4%.     

蛋白质交联——絮凝沉淀法筛选产转谷氨酰胺酶放线菌株的效果分析

为寻找一种廉价、快捷的方法选育转：谷氨酰胺酶（MTG）菌株，采用平板稀释法分离土壤放线菌，根据转谷氨酰胺酶催化反应结果的特性，设计了一种蛋白质交联-絮凝沉淀性能测定方法对分离菌株进行复筛，用比色法测定MTG酶活，并用插片法进行复筛菌株的初步鉴定。结果表明：从土壤中分离出16株放线菌，经复筛后有6株放线菌产生沉淀，即具有MTG酶活性，且其中LH-011的MTG酶活最大，达0．76u·mL^-1.经初步鉴定，6株放线菌均属于放线菌科链霉属。可见，用蛋白交联-絮凝沉淀性能测定的方法可以筛选出产MTG菌株。     

枯草芽胞杆菌α-淀粉酶高产菌株的选育

以Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１４１４０为出发菌株，经亚硝基胍反复多次处理和筛选，该菌α－淀粉酶酶活从８０００Ｕ／ｍｌ提高到３４２００Ｕ／ｍｌ，并探讨了一种高效的α－淀粉酶选育方法．另外在摇瓶培养过程中，探讨了培养基碳源、氮源对该菌株产酶特性的影响．     

酶制剂处理羽毛粉效果的研究

为探索酶制剂处理水解羽毛粉提高其蛋白质利用率的效果，首先采用６个不同浓度的复合蛋白酶制对水解羽毛粉进行酶解。得出以１．２０ｇ／ｋｇ酶浓度酶解的羽毛粉，，可溶性蛋白含量较高。然后采用Ｓｉｂｂａｌｄ鸡“ＴＭＥ”测定法，测定用１．２０ｇ／ｋｇ酶浓度酶解羽毛粉的氨基酸利用率，并以水解羽毛粉和鱼粉为对照。结果表明，酶解羽毛粉氨基酸利用率显著高于水解羽毛粉，而与鱼粉无显著差异。     

酶制剂处理羽毛粉效果的研究

为探索酶制剂处理水解羽毛粉提高其蛋白质利用率的效果，首先采用６个不同浓度的复合蛋白酶制剂对水解羽毛粉进行酶解。得出以１．２０ｇ／ｋｇ酶浓度酶解的羽毛粉，可溶性蛋白含量较高。然后采用Ｓｉｂｂａｌｄ鸡“ＴＭＥ”测定法，测定用１．２０ｇ／ｋｇ酶浓度酶解羽毛粉的氨基酸利用率，并以水解羽毛粉和鱼粉为对照。结果表明，酶解羽毛粉氨基酸利用率显著高于（Ｐ＜０．０５）水解羽毛粉，而与鱼粉无显著差异（Ｐ＞０．０５）。     

嗜热角蛋白降解菌的分离筛选及降解特性

为获得高效降解羽毛角蛋白的嗜热微生物，提高微生物降解角蛋白的效率，利用以羽毛角蛋白为唯一碳氮源的培养基从堆肥样品中分离降解菌，并对其菌种分类、粗酶液的酶学性质及降解角蛋白机理进行研究。通过选择培养基共筛选到5株高温降解菌，其中，菌株K-7降解性能和生物安全性能最佳。结合菌株形态特征、生理生化特征及16S rDNA系统进化树分析，鉴定该菌株为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)。在含角蛋白底物培养基中，K-7的发酵上清液可检测到较强的角蛋白酶活，但未检测到明显的二硫键还原酶活；同时，在降解过程中，产生了大量的亚硫酸盐和巯基化合物，表明亚硫酸盐裂解是角蛋白二硫键断裂的主要方式。酶学特性结果显示，粗酶液的最适反应温度为50～70℃,最适反应pH值为7.0～8.0,粗酶液在80℃以下时热稳定较好，SDS、PMSF和EDTA等化学试剂对酶活有较强的抑制作用，而DTT、β-巯基乙醇对酶活性有显著的增强作用。研究结果扩展了副地衣芽孢杆菌的应用领域，丰富了嗜热角蛋白降解菌的菌种资源库。     

黑曲霉和里氏木霉原生质体形成与再生条件选择──Ⅱ．菌龄、酶配比及酶解温度和时间的选择

用正交试验比较了菌龄、酶种类及浓度配比、酶解温度和酶解时间４个主要因素，对黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡＭＳ１１和里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ９４１４两菌株原生质体形成与再生的影响。结果表明，ＡＭＳ１１和ＱＭ９４１４两菌株原生质体形成与再生的４个因素的合理参数分别是：菌龄１４～１６小时和１８～２０小时；三种酶配比（纤维素酶：蜗牛酶：溶菌酶）（ｍｇ／ｍｌ）为（８：４：２）和（５：２．５：２．５）；酶解温度均为３２℃；酶解时间均为２～３小时。     

嗜麦芽窄食单胞菌YJ-1角蛋白酶底物特性及酶活测定方法研究

从羽毛加工厂污泥中分离到一株嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)YHYJ-1,对羽毛、羊毛和毛发底物均具有降解作用。菌株YHYJ-1对不同底物的降解能力存在差异,培养36 h羽毛完全降解,羊毛降解时间是72 h,毛发则在84 h有部分降解作用。分别以可溶性羽毛角蛋白、羽毛粉和偶氮角蛋白为底物进行酶活测定,以最高酶活值设定为100%,3种底物的相对酶活分别为100%、65.1%和23.2%,表明菌株YHYJ-1角蛋白酶的最适底物为可溶性角蛋白。菌株YHYJ-1接种于羽毛粉培养基,培养20 h后角蛋白酶活性急剧升高,28 h酶活达最大值,之后快速下降。     

强化羽毛粉饲喂肉鸡试验

用强化羽毛粉取代肉鸡饲料配方中的鱼粉进行了肉鸡饲养试验。结果表明:膨化确是加工羽毛的有效方法,用一些天然蛋白质强化后的“强化羽毛粉”可以取代原配方中的鱼粉,其体重与对照无明显差异,达到了相同的经济效益,并且能减少鱼粉进口及环境污染。     

烟草与药用植物的科间杂种染色体数目变化与性状变异

本文着重研究了烟草与药用植物科间杂交种的各世代染色体数目的变化,主要农艺性状的变异。此项研究是结合培育含有医药成份的新型烟草品种而进行的。杂种 F_1——F_6细胞染色体呈杂合状态,但有的杂种随世代进展。烟草染色体数目 N=24的比例,逐代增加。其主要农艺性状与烟草相似。个别性状倾向药用植物亲本,只有部份性状产生变异。杂种后代含医药成份及烟草固有化学成份。培育的品种,已在生产上应用,并取得了一定的社会效益和经济效益。经文献检索、利用烟草与药用植物进行科间有性杂交,培育出新型烟草,国内外尚无先例。     

水稻品种光、温反应特性在杂种F_1的表现

本研究于1977年在雅安市本校农场,就五个光、温反应特性不同品种:DissiD52/37、矮脚南特、矮子占、71—56、IR_8作亲本,采用非限定半双列杂交获得10个杂种F_1,对其高温短日生育期、短日促进率(短日敏感性),高温促进率(感温性)进行了测定。结果(1)短的高温短日生育期在杂种F_1表现呈完全显性或超亲显性;(2)在适温条件下,短日促进率(短日敏感性)高的,在杂种F_1表现为完全显性或超亲显性。并观察到在适温以下低温条件,明显抑制了短日敏感性的表现;(3)在自然日照下,高温促进率低的特性,杂种F_1表现为完全显性,而在短日处理下结果恰相反,即高温促进率高的为完全显性或超亲显性。另外,讨论了水稻品种光、温特性之间的相互制约关系。     

链霉菌分解角蛋白的生化机制研究 Ⅲ含硫化合物对角蛋白酶作用机理和角蛋白降解的生化机制初步研究

硫酸钠、亚硫酸钠和巯基乙醇对角蛋白酶具有强烈的激活作用，使角蛋白酶活力分别依次提高了４，７和２０多倍，其主要表现作用于角蛋白酶中的二硫键还原酶。亚硫酸钠在０．０１ｍｏｌ／Ｌ浓度下不仅作用于二硫键还原酶，而且还作用于多肽水解酶。硫代硫酸钠对二硫键还原酶有强烈的抑制作用。角蛋白酶降解羽毛角蛋白首先是角蛋白酶中的二硫键还原酶使角蛋白中二硫键裂解产生变性角蛋白，然后在多肽水解酶的共同作用下，将变性角蛋白逐渐分解成多肽、寡肽和游离氨基酸，使角蛋白彻底分解。角蛋白酶中的二硫键还原酶是降解角蛋白的关键酶。     

链霉菌B221的角蛋白降解机制初探

利用本实验室自行分离得到的链霉菌B221液体发酵分解羽毛角蛋白,在第2d到第3d角蛋白降解最为迅速,5d后角蛋白降解率达到82.7%。发酵液的无细胞上清液中检测到角蛋白酶活,最大酶活出现在第4d。在角蛋白降解率与角蛋白酶活之间的不完全对应,揭示可能还存在非酶降解途径。硫酸盐是角蛋白降解过程中硫元素的主要转化形式。同时在发酵液中检测到亚硫酸盐,其含量变化与酶活、降解率、可溶性蛋白、巯基化合物的变化存在很强的相关性,表明亚硫酸盐在角蛋白降解中可能起到非常关键的作用。链霉菌B221降解角蛋白的过程中不但存在角蛋白酶降解途径,而且存在非酶降解途径—亚硫酸分解作用。     

野生甘蔗 S.spontaneum 和 S.robustum 杂种后代的种性表现及其在育种上的应用

野生甘蔗的进一步利用,是当前把甘蔗育种工作推向新阶段的主要希望。但是,野生甘蔗杂种早代通常存在着高产量、低糖分、高纤维分的倾向。怎样恰到好处地利用野生甘蔗的种性,创造蔗糖分符合要求的高产品种,进一步提高育种效果,是本研究的主要目的。本研究采用7个杂交组合,包括 S.spontaneum 杂种的回交一代(BC_1)和回交二代(BC_2),以及 S.robustum F_1 同 S.spontaneum F_1 正反交(即二个野生种杂种后代早代正反交)。综合产量性状和质量性状的研究表明,BC_1虽具高产的植株多,但几乎没有含糖分达10%以上的植株,所以不是以制糖为目的的育种的选择世代,但它是理想的能源育种和创造新优良亲本的重要选择世代。BC_2虽包含高产的植株少,但尚有18%的较高生产水平的植株,而且有1/4的植株含糖分在10～14%,具其他优良质量性状的蔗株也较多,所以,是培育蔗糖分符合要求的高产品种的重要选择世代。S.rob F_1和 S.sp F_1正反交,其质量性状和产量性状都下降,所以,对以制糖或能源为目的的育种都没有意义。遗传参数的分析表明,茎数、茎径和茎生长量的广义遗传力强,遗传型变异系数较大,相对遗传进度高,所以,只要选择好回交亲本,可以指望在 BC_2获得优良品种。     

蹄甲角蛋白酶高产菌株的紫外诱变及酶学性质研究

为了得到蹄甲角蛋白酶高产菌株,本试验对1株产角蛋白酶的黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)N5菌株进行紫外诱变,筛选得到高产突变株U3-22,利用考马斯亮蓝法测定U3-22菌株的角蛋白酶发酵活力达69.9U/mL,比出发菌株的25.4U/mL提高了2.75倍。该角蛋白酶最适反应温度是70℃,最适pH是7.5;K+、Mg2+、Na2SO3对该角蛋白酶有较明显的促进作用,而Mn2+、Zn2+的抑制作用较为明显;突变株U3-22产生的角蛋白酶对蹄甲粉具有很强的分解能力,且具有较好的热稳定性和pH稳定性。结果表明,U3-22产生的角蛋白酶是一种新型的耐高温、耐酸碱角蛋白酶,在动物蹄甲、羽毛等废弃资源的利用中有巨大的应用前景。     

哈尔滨地区番茄病毒病的发生与毒源类型鉴定的研究

1981和1982年,在哈尔滨地区11个点,调查不同栽培方式和不同品种番茄病毒病的发生情况和以含抗 TMV 基因的品种为亲本所获杂种一代抗病性的表现,并对病毒病毒源类型进行鉴定。结果指出,感病程度因不同品种而异,同一品种在不同栽培条件下抗病性也不同。强力米寿(具有抗 TMV 的 Tm-1基因)有一定的抗病性,但在某些条件下发病率很高。以矮黄(具有抗 TMV 的 Tm-2nv 基因)和俄亥俄 MR-9(具有抗TMV 的 Tm-2~a 基因)为亲本的 F_1,田间抗病性显著高于对照品种6613。两年来,先后25批采集病毒标样共250个,在无虫网室内经过生物鉴定和物理抗性测定,指出在哈尔滨地区番茄病毒病的主要毒源类型是烟草花叶病毒(TMV)。研究结果指出,用含 Tm-2nv 和 Tm-2~a 抗病基因的番茄品种与经济性状优良的番茄品种杂交获得抗病性高、经济性状优良的杂种一代或育成新的抗病品种,是解决番茄上烟草花叶病毒的有效途径。