赞皇大枣枣疯病植原体分子分类

 【目的】枣疯病是一种重要的植原体病害，本试验旨在明确惟一已知的天然三倍体品种--赞皇大枣枣疯病植原体的分类地位，为赞皇大枣枣疯病植原体分类研究提供参考。【方法】利用植原体16S rDNA通用引物对赞皇大枣枣疯病病株的DNA进行PCR扩增和克隆测序，通过BLAST比对进行序列分析，利用临位相连法构建16S rDNA系统演化树，并应用DNAstar软件进行虚拟RFLP分析。【结果】获得的赞皇大枣枣疯病植原体16S rDNA序列长度为1 850 bp（GenBank登录号GU184180），包括1 529 bp的16S rDNA基因全序列、264 bp的邻近间隔区序列及57 bp的23S rDNA部分基因序列。同源分析表明，赞皇大枣枣疯病病原16S rDNA序列与其它植原体的相似性在87%—98%，其中与榆树黄化 Elm yellows（EY）(GenBank登录号l33763)最高相似性为98%；与大多数二倍体枣品种的植原体序列相似率达99%以上；其虚拟RFLP图谱与4个16SrⅤ亚组的代表序列图谱差异显著,赞皇大枣枣疯病植原体延伸因子tuf基因的序列(GenBank登录号JN001985) 比对结果表明，与其它亚组序列同源性为52.3%—76.7%。【结论】三倍体赞皇大枣枣疯病病原属于榆树黄化组(16Sr V)，并与其中的B亚组亲缘关系最近；与二倍体品种的病原分类地位一致，说明枣疯病植原体在系统进化上比较保守。     

枣疯病植原体的分子检测与同源性鉴定

【目的】采用植原体16S通用引物建立枣疯病植原体PCR检测体系。【方法】采用植原体16S rDNA通用引物R16mF1/R16mR1,对陕西和山西具有枣疯病的枣树植株总DNA进行PCR扩增,获得了相关的枣疯病植原体序列。采用DNAMAN软件分析其同源性,绘制系统进化树。运用pDRAW32软件对17种具有16S rDNA分组的典型的限制性内切酶进行计算机模拟RFLP,确定枣疯病植原体同源性关系。【结果】从陕西和山西的枣疯病的植株中,分别得到1 433 bp和1 432 bp的条带,与已报道的枣疯病植原体比较,同源性达到99%以上,而与其他植物的植原体16S rDNA同源性多低于93%,并且与16S rDNA V-B组的遗传距离最近。pDRAW32软件模拟RFLP结果表明它们和已报道的JWB的RFLP图谱相似。【结论】枣疯病植原体归属于16SrDNA V-B,为枣疯病植原体PCR检测体系提供了理论基础。RFLP分析进一步验证了枣疯病植原体属于16SrDNA V-B,具有随地域变异性较小的特性,这将有利于不同地区枣疯病检测技术的建立。     

苦豆子丛枝病植原体的分子检测与鉴定

【目的】对苦豆子丛枝病植原体做出分子检测与鉴定。【方法】通过PCR扩增技术,分别利用植原体16S rRNA基因,16S-23S rRNA间区及tuf基因序列的通用引物对表现丛枝病症状的苦豆子总DNA进行扩增,得到约1.2、0.3和0.8 kb特异片段。将所得片段分别进行克隆、测序及序列同源性分析。【结果】苦豆子丛枝病植原体(SAWB)上述3序列与榆树黄化组B亚组(16SrV-B)的枣疯病植原体(JWB)相应序列的同源性最高。【结论】苦豆子丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员。     

枣疯植原体rp基因和secY基因序列分析

【目的】基于核糖体蛋白基因(rp)和运输蛋白基因(secY),明确了陕西、山西及山东3省枣疯植原体的亚组分类地位。【方法】采集陕西、山西及山东3省枣产区的枣疯病样品,提取样品总DNA;设计引物对rpF1、rpF2、rpR1和secF1、secF2,对枣疯植原体的rp基因和secY基因进行PCR扩增及核苷酸序列测定与系统发育分析。【结果】获得枣疯植原体的rp基因和secY基因,大小分别为1 196和1 421bp。序列比对结果表明,陕西、山西及山东3个省枣疯植原体的rp基因和secY基因序列均一致;系统发育分析表明,这3省的枣疯植原体与樱桃致死黄化植原体(CLY5)和桃树黄化植原体印度株系(PY-In)的亲缘关系最近。【结论】以rp和secY基因作为植原体16SrRNA基因分类系统的辅助分子证据,将陕西、山西、山东的枣疯植原体归属到16SrⅤ-B亚组,明确三省内枣疯植原体的亲缘关系。     

安徽地方枣种质枣疯病植原体16S rDNA序列分析

为研究安徽地方枣种质枣疯病16S rDNA序列特性,以健康及表现枣疯病症状的繁昌长枣叶片DNA为模板,克隆枣疯病植原体16S rDNA序列,获得1条1 248 bp的片段,命名为JWB-FJP1。同源性分析结果表明,JWB-FJP1属于16Sr V-B组,与重庆地方枣枣疯病植原体JWB-Xch(JQ675716)同源性最高,达到99.92%;与河北枣枣疯病植原体JWB-Hebei(GU184186)同源性最低,为67.06%,说明不同地区枣疯病植原体存在一定的生物学特异性。本研究结果为安徽地方枣种质枣疯病病原分类及其快速鉴定提供了理论依据。     

secY和nusA基因在泡桐丛枝植原体亚组分类中的应用

【目的】利用分子生物学方法分析泡桐丛枝植原体转运蛋白secY基因及转录延伸因子nusA基因,从亚组水平上确定陕西泡桐丛枝植原体的分类地位。【方法】采集陕西杨凌、彬县、旬邑、永寿、周至和宝鸡等6个泡桐栽培区的泡桐丛枝样品,提取病样总核酸;设计引物对secY-F/R和nusA-F/R,对泡桐丛枝植原体secY、nusA基因进行PCR扩增及核苷酸序列测定与系统发育分析。【结果】获得了泡桐丛枝病植原体secY基因序列的全长,大小为1 358bp,编码414个氨基酸;获得了部分nusA基因序列,大小为946bp,编码315个氨基酸。序列同源性分析结果表明,陕西各县区泡桐丛枝植原体的secY、nusA基因序列均一致。一致性分析和系统发育分析表明,陕西泡桐丛枝植原体与台湾泡桐丛枝植原体的亲缘关系最近,secY、nusA基因序列的同源性分别为99.9%和99.6%。【结论】首次报道了泡桐丛枝植原体转运蛋白secY基因及转录延伸因子nusA基因的序列,并以其作为分类标准,将陕西泡桐丛枝植原体归属到16SrⅠ-D亚组。     

北京地区枣疯病植原体16SrDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段.对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%.序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组.     

北京地区枣疯病植原体16S rDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段。对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1 248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%。序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组。     

小麦蓝矮病植原体延伸因子(EF-Tu) tuf基因序列的同源性分析

 【目的】利用分子生物学方法分析小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因，从亚组水平上确定小麦蓝矮病植原体的分类地位。【方法】电镜观察自然发病的小麦蓝矮病病叶；用引物fTufu/rTufu对小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因进行PCR扩增；核苷酸序列测定及分析。【结果】经电镜超微结构观察，在韧皮部观察到大量典型植原体。通过PCR扩增得到约850 bp的特异片段。感受态转化后，进行测序，结果表明小麦蓝矮病植原体tuf基因片段长842 bp，编码280个氨基酸。分析比较15种植原体延伸因子tuf基因的同源性，结果表明小麦蓝矮病植原体与三叶草绿变（KVF）亲缘关系最近，核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为100％。【结论】从亚组水平上确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位，为研究小麦蓝矮病植原体的来源及致病分子机理提供理论依据。     

陕西枣疯病发病规律与苗木带病检测

从彬县、佳县和清涧县采集的枣树苗、酸枣苗、枣树昆虫样品中提取总核酸,克隆与测序。结果表明,陕西彬县、佳县和清涧县3个枣区的枣疯病(JWB)植原体16S rDNA基因大小为1.2kb,基因序列基本一致,为同一个种,JWB和酸枣(WJWB)植原体16SrDNA的亲缘关系达到99.9%。由于JWB与16S rⅤ组B亚组成员榆树黄化(Elm yellows, EY)和悬钩子丛枝病(Rubuswitches’broom,RuS)的同源性分别是98.5%和98.3%。因此,JWB归属于植原体16S rⅤ组B亚组。PCR检测苗木结果显示,市场上的枣树苗带病较多,以佳县枣树苗的带病率最高,达到7.69%,彬县带病率最低,为4.35%;清涧县酸枣苗的带病率最高,达到19.05%。对枣疯病品种抗病性调查结果显示,‘婆枣’发病率较高(25.32%),‘晋枣’发病率最低(11.18%)。对在彬县与佳县枣园采集的中华拟菱纹叶蝉(Hishimonoides chinensis)、凹缘菱纹叶蝉(Hishimonus sellatus)、大青叶蝉(Cicadella viridis)和条沙叶蝉(Psammotettix striatus),用PCR检测带毒情况,结果显示,只有中华拟菱纹叶蝉和凹缘菱纹叶蝉携带枣疯病植原体,说明这两种叶蝉是陕西的枣疯病的媒介昆虫。在温室内,采用菟丝子和嫁接方式,能够传播枣疯病。     

基于secY基因对山东临沂枣疯病植原体的分子鉴定

利用FD9f／r引物对采自山东临沂的枣疯病样品进行secY基因的PCR扩增，并进行了序列测定，结果表明，该特异片段大小为1421bp。对获得的序列与NCBI数据库中相关植原体序列进行同源性分析、构建系统进化树和模拟RFLP分析，结果显示山东临沂枣疯病植原体属于secYV—C亚组，与secYV—B亚组的樱桃致死黄化株系（CLY5）和secYV—N亚组的桃树致死黄化印度分离株系（PY—IN）的亲缘关系最近，在亚组水平上进一步明确了山东临沂枣疯病植原体的分类地位。     

枣疯病病树中内源激素的变化研究

【目的】揭示枣疯植原体对枣树内源激素的影响，弄清枣疯病病树中内源激素的变化趋势。【方法】应用HPLC法分别对健株、病株和盐酸土霉素治疗后转健植株中的细胞分裂素（玉米素，Zeatin）、生长素（吲哚乙酸，IAA）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）的含量进亚周年检测。【结果】在根部，健株、治疗株和病株中IAA、GA3和ABA的含量没有明显区别，但在7、8月份病株根部中Zeatin的含量要明显高于健株；在叶部，健株、治疗株和病株中的IAA、GA3和ABA的含量也没有明显区别，但在生长后期病株叶片中Zeatin含量显著高于健株。不同患病程度叶片中激素的比较结果表明，患病程度越重，Zeatin/IAA（C/A）比值越高。【结论】植原体侵染枣树植株后致使其内源激素失衡，主要是细胞分裂素含量的增加，最终导致了枣疯病症状表现。     

枣疯病植原体新疆分离物16S rDNA基因克隆与序列分析

利用植原体16SrDNA基因保守序列通用引物对新疆阿克苏地区和喀什地区的疑似枣疯病植株总DNA进行常规PCR和巢式PCR检测,分别扩增出1.5kb和1.2kb的特异性片段。对片段进行克隆、序列测定分析及系统发育树构建,结果表明,新疆枣疯病阿克苏分离物和喀什分离物的16SrDNA基因序列同源性极高,达到100%,与16SrⅤ组植原体的同源性达到98.4%以上,并且与16SrⅤ-B亚组中的枣疯病山东莱芜株系、山东龙口株系同源性最高,达到99.5%,因此归属于榆树黄化组16SrⅤ-B亚组。首次报道新疆枣疯病植原体16SrDNA的序列,确定新疆枣疯病植原体的分类地位,为枣疯病的早期诊断和检测提供依据。     

四川斑竹丛枝病植原体检测及16S rDNA片断序列分析

丛枝病是竹子的一类常见的重要病害,除瘤座菌外,很多报道认为植原体也是丛枝病的病原。笔者提取斑竹丛枝部位和健康组织中的总DNA,选用通用引物对植原体的16S rRNA基因进行巢式PCR扩增,得到一条约1.2kb的目的片段,而在健康植株内却没有此特异片断,表明患病植株中有植原体存在,将此植原体株系命名为PhB-WB。通过16S rDNA片断核酸序列同源性比较,结果表明斑竹丛枝病植原体是一种属于16SrⅠ组的植原体,基本确定了其分类地位。     

许昌泡桐丛枝病植原体的分子鉴定

对采自河南许昌的表现丛枝症状的泡桐样品进行了病原鉴定,并通过序列同源性分析确定了其分类地位。采用16SrDNA基因的通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2和延伸因子(EF-Tu)tuf基因的通用引物fTufu/rTufu,对样品总DNA进行PCR扩增,分别得到了约1.2kb和840bp的特异条带。经克隆测序,并在NCBI网站比对分析,确定所得序列分别为植原体特定的16SrDNA和tuf基因序列。将测得序列与已报道的翠菊黄化组植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,显示河南许昌的泡桐丛枝病植原体属于16SrⅠ-D亚组。     

枣疯病植原体越冬后向枣树不同类型新生组织转移特性研究

为明确枣疯病植原体越冬后向新生组织的转移扩散特点,从而指导枣疯病预防和控制,本研究采用PCR和DAPI荧光显微技术,比较枣疯病植原体向枣树不同类型新生组织的转移情况。结果表明:室内水培的疯枣枝在萌芽30d后,新生叶片可以检测到植原体;自然栽培枣树的枣股新生叶片生长发育至24d出现植原体;枣树根蘖在萌芽后12d即可检测到植原体。嫁接试验表明,嫁接于染病冬枣砧木上的易感品种接穗‘唐星’,‘阜星’,其萌发的新生幼叶在第34天即可检测到植原体,而抗病品种‘星光’接穗在第119天才检测到植原体。由此可见,枣疯病植原体在地上和地下部分均可以越冬,越冬的植原体向枣树不同类型和不同品种新生组织中的转移扩散速度存在差异,由快到慢为根蘖>自然生枝条>离体水培枝条>嫁接接穗。     

骏枣不同株系间的枣疯病抗性多样性

【目的】揭示骏枣品种内枣疯病抗性多样性,筛选高抗枣疯病的骏枣株系。【方法】以骏枣的16个株系为试材,通过田间调查和PCR检测,研究不同株系在嫁接侵染枣疯病后的症状表现和病原侵染情况;利用“合成-合理满意度”和多维价值理论的合并原则,对不同株系果实的相对含水率、单果重、可食率、果形指数、Vc含量、可溶性糖和可滴定酸含量等性状指标进行综合评价;采用AFLP技术对不同株系进行基因组遗传多样性分析。【结果】不同株系对枣疯病抗性表现出显著差异,可分为感病型、延迟感病型、延迟抗病型和抗病型4种类型,T15、J2、J5、J8这4个骏枣株系高抗枣疯病,其中,T15、J5和J8的果实综合性状在骏枣株系中亦居于较高水平;进一步的AFLP分析发现,不同抗性类型间在基因组水平上存在一定差异。【结论】筛选出了4个抗枣疯病骏枣株系,其中3个株系果实综合品质良好。