猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。     

猪瘟疫苗毒株和流行毒株RT-nPCR检测方法的建立

为给临床快速鉴别诊断猪瘟提供技术依据,根据GenBank公布的CSFV全基因序列,结合猪瘟序列测定结果,针对NS5B基因区域设计2条通用外扩引物、2条通用内扩引物和1条疫苗毒株特异性内扩引物,建立一种可鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株的RT-nPCR诊断方法。结果显示,该方法可从HCLV株扩增出2条大小分别为261bp和157bp的片段,可从Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002等流行毒株扩增出1条261bp的片段,其他几种常见猪病毒检测均呈阴性;灵敏度试验表明,检测的cDNA质量浓度极限为3.4×10-7 pg/L;116份临床样品中有37份样品检测呈阳性,阳性率为32%;分析部分阳性病料E2基因序列也证实检测结果的准确性。说明:建立的RT-nPCR鉴别诊断方法灵敏度高、特异性好,能直观区分猪瘟疫苗毒株和流行毒株。     

一种鉴别猪瘟C-株和其他毒株的分子生物学方法

根据已发表的猪瘟病毒(CSFV)核苷酸序列,筛选出C-株与其他毒株的核苷酸序列差异标记CTTTTTTCTTTT,并设计包含此标记序列的CSFV特异性PCR引物对及nested-PCR引物对。从待检猪脾脏或淋巴组织中提取总RNA,用AMV逆转录酶进行逆转录后,进行PCR和nested-PCR。将扩增片段纯化回收并克隆到pMD18-T载体进行测序。对测序结果进行分析,含有此标记序列的即为C-株,不含此标记序列的则为其他毒株。     

荧光定量RT-PCR鉴别IBDV超强毒株与经典疫苗毒株

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒株的出现给该病的防控带来了新的困难,有效鉴别IBDV超强毒株对IBD的防控有着积极意义.根据IBDV VP4基因的保守序列,设计了一对通用引物RPa/RPb,特异性扩增IBDV VP4基因720 bp的目的片段.根据超强毒株和经典毒株VP4基因序列的差异,分别合成了FAM标记的超强毒荧光探针和JOE标记的经典毒荧光探针,建立了实时荧光RT-PCR鉴别IBDV超强毒株与经典疫苗毒株的方法.检测超强毒和经典毒的敏感性分别可达420和320个拷贝数.建立的实时荧光RT-PCR方法敏感性高、特异性强,可用于临床样品中IBDV超强毒和经典毒的鉴别诊断.     

猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因,设计合成2对特异性扩增引物,用以扩增PEDV S基因和ORF3基因,通过目的片段的数量和片段大小来判断PEDV的毒株类型;通过对退火温度等反应条件的优化,建立了检测不同PEDV毒株类型的多重RT-PCR鉴别检测方法。结果显示,所建立的多重RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株;PEDV变异毒株扩增出2条目的条带,分别为234 bp的ORF3基因片段和826 bp的S基因片段;PEDV经典毒株扩增出1条目的条带,片段大小为234 bp的ORF3基因片段;而弱毒疫苗株扩增出1条目的条带,片段大小为185 bp的ORF3基因片段;与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒、猪细环病毒及猪细小病毒均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μl;且该方法具有良好的重复性。利用该方法对采集自广西部分地区的91份临床腹泻样品进行检测,样品中PEDV阳性样品有64份,其中变异毒株占89.06%(57/64),经典毒株占4.69%(3/64),弱毒疫苗株占6.25%(4/64)。结果表明,该多重RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原的鉴别诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。     

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

[目的]建立一种能区分猪瘟病毒（classical swine fever，CSFV）强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-nPCR）检测方法。[方法]根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列，选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物，并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物，建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。[结果]应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段，但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0．04pg的CSFV RNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测，结果表明，有14份类似猪瘟强毒，1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。[结论]本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒，减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。     

猪瘟强弱毒鉴别多重RT-PCR方法的建立及应用

【目的】建立一种能够应用于临床样本猪瘟病毒(CSFV)检测的快速、简便且标准化程度高的检测技术,以满足畜牧业生产和兽药市场的需求。【方法】根据GenBank中猪瘟病毒及近源病毒的基因组全序列,选择特异保守区域设计了2对猪瘟病毒引物,借助3′端引物碱基错配对PCR扩增效率的影响,优化筛选了能够鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒疫苗的PCR退火温度,经多重试验组合建立了一套鉴别猪瘟强毒和弱毒的多重RT-PCR鉴别诊断方法。【结果】扩增反应条件的确定试验表明,退火温度为55℃;特异性分析表明,从弱毒C株和石门强毒株的基因组中分别扩增出1条大小为492和178 bp的特异性片段,从强弱毒株混合物中1次扩增出2条大小为492和178 bp的特异性片段,检测不到伪狂犬病病毒的RNA;敏感性分析表明,该方法能检测出0.8 pg的猪瘟病毒RNA;应用试验表明,8份疑似猪瘟病料中5份为强毒感染,2份为弱毒感染,1份为弱毒和强毒的混合感染。【结论】研究建立的多重RT-PCR方法具有敏感性、特异性强、重复性好的特点,对养猪业的发展具有十分重要的意义。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

【目的】 利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒（PEDV）自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95.8%—97.1%。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基因,其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300 bp ,而弱毒疫苗株则为250 bp左右;该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增,其敏感性可达到100TCID50/0.1mL,对仔猪腹泻临床样品检测结果显示,PEDV自然感染的阳性率为65.4%。【结论】 初步建立了基于PEDV ORF3基因的RT-PCR鉴别诊断方法,该方法可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株,为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速的检测方法。     

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列,针对IBVM基因全序列设计合成了一对引物,以IBV疫苗株为模板,建立了检测IBV的RT-PCR方法.应用该方法对IBV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1105 bp的特异性目的片段;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的IBV-M-cDNA.结果表明建立的RT-PCR方法对IBV的检测敏感性高、特异性强,可用于IBV感染的诊断和流行病学调查.     

鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株RT-PCR方法的建立

为临床上能鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株和疫苗株,根据GenBank中已发表的PEDV疫苗株ORF3基因序列,在245~293位缺失区域两侧设计合成1对特异性引物,建立了快速鉴别和诊断PEDV野毒株和疫苗株的RT-PCR方法,即PEDV野毒株、疫苗株基因组中分别可扩增出长度为282和233bp的特异性片段,而对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪博卡病毒、猪伪狂犬病毒核酸扩增均为阴性;对PEDV野毒株与疫苗株的最低检测下限分别为455拷贝/μL和396拷贝/μL。该方法不仅能够有效区分PEDV野毒株和疫苗株,而且能够鉴别发病猪的感染情况,为该病的防控提供了有效地技术保障。     

陕西省部分地区猪瘟流行毒株与疫苗毒株E2基因主要抗原区序列变异分析

研究陕西省猪瘟病毒E2基因主要抗原区变异情况,为猪瘟防控提供依据.用巢式PCR方法对猪瘟疫苗和采自陕西省部分地区的疑似猪瘟病料进行E2基因主要抗原区扩增并测序,将测序结果与HCLV疫苗株和Shimen株E2基因进行序列比对分析.结果表明,23株流行毒株之间的核苷酸同源性在86.0％～100％,氨基酸同源性在87.8％～...     

猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

经非猪瘟免疫猪增殖猪瘟病毒石门株,从抗凝血中直接提取病毒RNA进行RT-PCR,获得了猪瘟病毒石门株E2基因片段。克隆后测序,结果表明石门株的E2囊膜糖蛋白与国外报道的5株猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白具有相同的骨架结构,即均具有15个半胱氨酸残基和5个潜在糖基化位点,此外石门株也具有保守序列RYLASLH。同源性比较表明,石门株与日本的ALD株和GPE#+-株同源性最高,而与欧洲的Alfort株同源性最低。与国内的疫苗种毒（482代）、疫苗毒以及国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株同源性比较表明,石门株与种毒(482代)同源性最高,其次为国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株,而与国内使用的疫苗毒同源性最低。本研究提示国内疫苗毒的E2基因在生产中有较大变异,可能导致抗原漂移。     

罗氏沼虾诺达病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测MrNV的灵敏度大约为RT-PCR的103倍,最低可检测到2.612×10-2 fg MrNV RNA。应用套式RT-PCR和一步法RT-PCR同时对108份来自广西各地的罗氏沼虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有9份检出MrNV,而一步法RT-PCR仅有3份检出MrNV。由此可见,建立的套式RT-PCR检测方法具有极高的特异性和敏感性,能提高MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断,为WTD的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供可靠的技术手段。研究亮点:根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,优化建立了检测MrNV的套式RT-PCR方法。该方法具有极高的特异性和敏感性,最低可检测到2.612×10-2fg MrNV RNA,能提高临床样品MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断。     

猪瘟病毒新疆南疆野毒株E2基因序列分析及致病性研究

应用RT-PCR技术对新疆南疆两地的猪瘟阳性病料进行了扩增 ,并对扩增的产物进行了核苷酸序列测定.结果扩增的两株野毒的E2基因序列相同 ,与已知的中国C株E2基因相应序列比较,其同源性为82.8;,推导的氨基酸同源性为88.3;.用这两株野毒人工感染健康易感仔猪,观察其致病性,结果两株野毒引起的临床症状及剖检变化相似,均呈现比较典型的猪瘟病变.免疫酶组化显示,猪瘟病毒主要攻击脾脏、淋巴结等免疫器官,其次为肾脏、脑等器官.结果表明,NJKS、NJAKS两株野毒为中等毒力或偏强,能引起亚急性型猪瘟.     

4种猪群常见病毒基因芯片检测方法的建立与应用

【目的】建立猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪细小病毒(PPV)的基因芯片检测方法,为这4种病的实验室诊断和流行病学调查提供一种快速、高效的病原学诊断方法。【方法】根据GenBank中CSFV、高致病性PRRSV、PCV-2、PPV的相关基因序列,设计合成相关引物,采用PCR方法得到具有荧光标记的PCR产物,然后与含有特定检测探针的芯片进行杂交,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的灵敏性和重复性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法,对150份临床样品进行检测。【结果】建立了针对CSFV、PRRSV、PCV-2和PPV 4种病毒的基因芯片检测方法,该方法对临床150份样品的检测结果显示,CSFV阳性样品有25份,高致病性PRRSV阳性样品有45份,PCV-2阳性样品有70份,PPV的检测结果全部为阴性,其中混合感染样品有18份。【结论】建立了对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV 4种猪群常见病毒的基因芯片检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

广西猪瘟病毒E2基因克隆及序列分析

[目的]了解广西猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的变异规律及其与疫苗株的基因差异,为正确选择猪瘟疫苗和防制广西猪瘟提供参考依据.[方法]以广西本地的阳性猪瘟病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,经克隆、测序后用DNASTAR软件对其序列进行比对分析,并绘制遗传进化树.[结果]从41份疑似猪瘟病料中共扩增出4个阳性样品的E2基因(1140 bp),经序列比对分析发现,扩增获得的4株CSFV毒株(GXGG1、GXLC1、GXLC2和GXNN1)与兔化弱毒株(HCLV)、Shimen强毒株的核苷酸同源性为82.1%~82.3%和82.9%~83.4%、其推导氨基酸同源性为88.4%~89.2%和88.9%~90.0%,4株毒株间的E2基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为90.8%~99.6%和94.2%~99.5%,且均属于基因群Ⅱ;E2基因推导的氨基酸表明,E2蛋白空间结构及抗原结构的氨基酸位点693Cys、737Cys、792Cys、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、837Arg均未发生变异,但其单抗识别位点G713E、N729D、K734R发生变异.[结论]近年来广西CSFV流行毒株的变异未出现较大差异.与HCLV株、Shimen强毒株亲缘关系较远,但与Paderborn株、GXWZ02株亲缘关系较近.     

猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据猪乙型脑炎病毒(JEV)基因序列,设计合成了一对引物,以JEV疫苗株为模板,建立了检测JEV的RT PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为430 bp的特异性目的片段;RT PCR产物测序结果与文献报道的JEV不同毒株的序列同源性达到98%~100%;敏感性测定该RT PCR可扩增到10 pg的JEV-RNA。结果表明,建立的RT PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强。