L-精氨酸产生菌诱变育种及发酵条件优化

本文以Corynebacterium glutamicum DSM1412为出发菌株,经紫外线和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍逐级诱交处理和选育,并采用N-硝基-L-精氨酸甲酯进行抗性选育,获得一株高产L-精氨酸和遗传性稳定的菌株Corynebacterium glutamicum ZDNTG5.该菌种产L-精氨酸的量可达31 g/L,比出发菌提高了1.4倍.通过对发酵培养基优化,确定最佳摇瓶发酵条件为葡萄糖9.0%,玉米浆3.0%,(NH4)2SO4 6.0%,KH2PO4 0.05%,MgSO4·7H2O 0.03%,碳酸钙2.0%,接种量6%,pH 7.0,装液量15 mL/100 ml,转速100 rpm,30℃发酵培养96 h.在此条件下发酵,产酸量达44 g/L,产精氨酸的量比未经优化时提高了41.9%.     

L-色氨酸发酵条件研究

对谷氨酸棒杆菌JZ3356发酵的接种量、发酵温度和溶氧浓度等条件进行了研究。结果表明：该菌株的最佳发酵培养基组成为葡萄糖30 g/L、（NH4）2SO440 g/L、苯丙氨酸0.2 g/L、酪氨酸0.2 g/L、玉米浆25 mL/L、KH2PO410 g/L、MgSO4.7H2O4 g/L、Na2SO40.002 g/L、FeSO4.7H2O0.01 g/L、VB1100μg/L和VH50μg/L,流加糖为浓度70%的葡萄糖（质量体积比）;最佳发酵条件为pH值6.8,温度35℃,接种量10%,溶氧浓度控制在20%~30%。     

基于提高L-异亮氨酸生产效率谷氨酸棒杆菌构建和混菌发酵

L-异亮氨酸是多数哺乳动物必需氨基酸,广泛应用在食品、医药、运动营养等领域。为促进细胞内L-异亮氨酸外排,提高发酵液中L-异亮氨酸含量,以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)IBCL-1为出发菌株,构建CI01、CI02、CI03与IBCL-1ΔlysA 4株菌株。通过发酵对比CI01、CI02、CI03菌株生产L-异亮氨酸能力,其中CI01菌株L-异亮氨酸产量最高为21.36 g·L^-1,相较于出发菌株IBCL-1提高6.8%。为降低主要副产物L-赖氨酸含量,敲除合成IBCL-1中L-赖氨酸关键基因lysA,所获菌株IBCL-1ΔlysA可大量消耗外源L-赖氨酸。最后将CI01与IBCL-1ΔlysA菌株混合发酵生产L-异亮氨酸,确定13:1为两种菌接种量最佳配比,发酵液中L-异亮氨酸含量为22.96 g·L^-1,L-赖氨酸含量为0.42 g·L^-1,显著提高L-异亮氨酸生产效率。     

L-亮氨酸发酵培养基及基本发酵条件的优化

以黄色短杆菌FY-18为出发菌株,利用摇瓶发酵生产L-亮氨酸,并利用正交试验和单因素试验分别对其发酵培养基和基本发酵条件进行研究,从而优选出最佳培养基组分和培养条件参数。结果表明,L-亮氨酸发酵培养基的最适配比为:葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米浆20 g/L、毛发粉15 g/L、硫酸铵70 g/L;其发酵最佳培养条件为:初始p H 7.2,培养温度32℃,发酵接种量为10%。在上述最佳条件下摇瓶中发酵的产酸量为22.5 g/L。     

L-苏氨酸产生菌的选育

[目的]为苏氨酸基因工程菌的构建和苏氨酸的工业化生产奠定基础。[方法]以谷氨酸棒杆菌为出发菌株,采用紫外线（UV）诱变和硫酸二乙酯（DES）复合诱变进行诱变处理并筛选出AHV抗性突变株。[结果]用细菌选择性平板选出产酸菌株266株,用纸层析法从中选出产苏氨酸菌株3株,其产苏氨酸量分别为0．18、0．12和0．08g／L。在AHV浓度为0、1．5和3．0g／L的平板上,菌株X1的菌落多且大;在AHV浓度为4．5g／L的平板上,其菌落少且小;在AHV浓度为6．0和7．5g／L的平板上仅有几个小菌落。传代试验表明只有菌株UV-3能稳定产酸,产量比出发菌株高55．6％。在AHV浓度为4．5、6．0和7．5g／L的平板上,菌株UV-3的菌落多且大;在AHV浓度为9．0g／L的平板上,其菌落少且小;在AHV浓度为10．5g／L的平板上仅有几个小菌落。[结论]该试验成功选育出了一株稳定、高产并具有AHV抗性的L-苏氨酸产生菌。     

异柠檬酸裂解酶抑制剂对L-谷氨酸合成的影响

[目的]研究琥珀酸和苹果酸对L-谷氨酸合成的影响。[方法]以谷氨酸棒杆菌的典型茵株Corynebacterium glutamicum ATCC 13032为供试菌株,研究琥珀酸和苹果酸对细胞生长、L-谷氨酸的合成、发酵液中的残糖量以及细胞中异柠檬酸裂解酶活性的影响。[结果]琥珀酸对异柠檬酸裂解酶的活性具有部分抑制作用。在0-5．0g／L范围内,琥珀酸的添加提高了L-谷氨酸发酵的糖酸转化率,细胞生长和L-谷氨酸分泌受到抑制,残糖量增大。苹果酸的添加降低了异柠檬酸裂解酶的活性和L-谷氨酸的产量,残糖量和细胞生长没有明显的规律性变化。同时添加琥珀酸和苹果酸各2．0g/L时,异柠檬酸裂解酶的活性和细胞生长都有所下降,L-谷氨酸的产量和残糖量没有明显变化。[结论]添加琥珀酸增加了L-谷氨酸的产量,添加苹果酸则降低了L-谷氨酸的产量。     

亚硝基胍诱变选育L-苏氨酸高产菌的研究

为筛选出L-苏氨酸的高产菌,以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glu anicum)为出发菌,进行亚硝基胍(NTG)诱变处理选育试验.结果表明:筛选出蛋氨酸+赖氨酸+异亮氨酸缺陷型菌株Y-1(Met-+Lys-+Iso-),经摇瓶发酵72 h后,L-苏氨酸积累可达4.14 g/L.     

谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-精氨酸的溶氧条件优化

为了确定L-精氨酸发酵过程中最合适的溶氧浓度,通过控制5%、20%和35%这3种溶氧水平,探讨不同溶氧条件下的谷氨酸棒状杆菌ATCC14067-SG的L-精氨酸产量,并通过分析生长和关键代谢产物的方式,研究不同溶氧下精氨酸积累差异的原因。结果表明,在5%溶氧条件下,乳酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和谷氨酸的积累最高;35%溶氧条件下,乳酸、赖氨酸和鸟氨酸的积累有所改善,但丙氨酸和谷氨酸的积累仍然很高;在20%溶氧的发酵条件下,谷氨酸棒状杆菌的生长略好,且乳酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和谷氨酸的积累量显著降低。溶氧水平的不同,改变了谷氨酸棒状杆菌糖酵解和TCA循环的代谢流量。低溶氧条件下,TCA循环减弱,而过高的溶氧又会导致副产物的积累。在较为适中的20%溶氧下,谷氨酸棒状杆菌ATCC14067-SG的L-精氨酸产量最高,是35%溶氧水平的117.28%,5%溶氧水平的140.53%。     

两株细菌纤维素产生菌发酵条件优化初探

[目的]对分离获得的二株菌巴氏醋杆菌(ZHC菌)和葡萄糖酸杆菌(TAⅢ菌)的纤维素发酵工艺进行优化研究.[方法]采用单因素实验法和正交试验法,对两株菌进行发酵条件的初步优化,并对优化后的培养基进行产细菌纤维素的验证实验.[结果]单因素碳源实验表明,两株菌都能较好利用的碳源有葡萄糖、甘油、D-果糖、蔗糖,其中以甘油效果最佳;单因素氮源实验表明,两株菌对硫酸铵的利用效果都较差,蛋白胨和酵母膏为最佳复合氮源;验证实验表明:ZHC菌以培养基:甘油3;、蛋白胨1;、酵母膏0.45;、磷酸氢二钠0.2;,30℃,接种量5;,静置发酵10 d时,细菌纤维素产量达4.24 g/L.TAⅢ菌以培养基:甘油4;、蛋白胨1.2;、酵母膏0.45;、磷酸氢二钠0.3;,30℃,接种量5;,静置发酵10 d时,细菌纤维素产量达3g/L.[结论]在利用巴氏醋杆菌(ZHC菌)和葡萄糖酸杆菌(TAⅢ菌),发酵生产细菌纤维素时,甘油是最佳碳源选择,蛋白胨和酵母膏为最佳氮源选择.     

稀土元素镧对Corynebacterium pekinense发酵赖氨酸的影响

[目的]研究稀土元素镧对北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)的生长及产物合成的影响。[方法]通过全因子试验设计,分析了在北京棒杆菌的发酵培养基中添加不同配比稀土元素镧对其赖氨酸产量的影响。[结果]低剂量的稀土元素镧可以促进北京棒杆菌生长并积累代谢产物赖氨酸,利用Matlab软件优化培养基中显著影响成分,得到稀土镧离子的最佳浓度为78 mg/L,葡萄糖为36 g/L,牛肉膏为4.5 g/L,蛋白胨为20 g/L。[结论]该研究初步确定了在北京棒杆菌培养中,La+的适宜添加量及该菌产生赖氨酸的最适培养基组成。     

谷氨酸棒杆菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达

采用PCR方法从谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）基因组中分离得到2.4 kb的麦芽寡糖基     

代谢工程中的MFA&MCA及其具体应用

代谢工程(Metabolic Engineering)，亦称途径工程(Pathway Engineering)和代谢设计(Metabolic Design)，是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。对代谢工程中MFA、MCA进行了描述，并列举了它们在代谢网络分析和代谢工程中的应用实例。     

核黄素高产菌株的选育及发酵条件的优化

采用UV对棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)3#进行诱变,得到1株331#突变株,其核黄素合成速率明显提高,连续传代后仍能保持高产稳定性。通过正交试验,确认影响331#菌株核黄素产量的主要因素顺序为玉米浆>骨胶>豆油。在优化培养基配方的基础上,通过补料工艺,使核黄素发酵单位(每毫升发酵液核黄素的产量)达5 512μg/mL。     

海洋产几丁质酶菌株的筛选及发酵条件优化

通过透明圈法初筛、DNS复筛,从大连近海海域的海泥中分离出一株高产几丁质酶的菌株,经初步鉴定为扩展短杆菌(Brevibacterium linens).采用不同碳源、氮源、温度、pH值等对培养条件进行了优化及正交试验.结果表明:该菌产酶最适条件是在28℃、pH7.0、蛋白胨1g/L、胶体几丁质10g/L、NaCl 20g/L条件下,几丁质酶活力可达0.508 U/mL,比优化前其产酶活力提高了9倍.     

一株碱性果胶酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

采用平板分离结合刚果红染色法从野生苎麻土壤中分离得到1株果胶酶产生菌Lys-5304。经形态观察和16S r DNA测序鉴定,该菌株鉴定为欧文氏菌(Erwinia amylovora)。通过单因素试验和响应面分析,该菌产果胶酶的最优条件为:葡萄糖3.0 g/100 m L,菜子粕0.2 g/100 m L,接种量1.5 m L,培养基起始p H 8.0,摇床转速180 r/min,发酵周期为72 h,培养温度为37℃。在此条件下,该菌的果胶酶活力达到1 021.33 U/m L,具有一定应用潜力。     

谷氨酸棒状杆菌乙酸盐代谢PTA、AK、ICL和MS酶活性研究

从谷氨酸棒状杆菌乙酸盐代谢中涉及的磷酸转乙酰酶PTA、乙酸盐激酶AK、异柠檬酸裂解酶ICL和苹果酸合成酶MS 4种酶入手,建立了一套稳定的酶活性测定方法,并对这些酶在葡萄糖和乙酸盐不同碳源代谢中的酶活性特征进行了比较分析,发现碳代谢中存在葡萄糖效应;乙酸盐对谷氨酸棒状杆菌PTA、AK、ICL和MS酶活性有明显的诱导作用.     

产恩拉霉素链霉菌的诱变及其发酵条件的优化

为满足恩拉霉素工业化生产对高产菌株的需求,采用N+注入技术和单因素及正交试验方法对产恩拉霉素链霉菌(Streptomyces sp.)NJWGY3665进行诱变,并对目的菌株的最佳发酵条件进行优化。结果表明:随N+注入剂量的增加,菌株的存活率呈典型的马鞍型剂量-效应曲线。在最佳注射剂量120×1013ions/cm2条件下筛选到1株具有遗传稳定性的高产链霉菌突变菌株LD1;该菌株发酵最适培养基条件为蔗糖50g/L,酵母粉20g/L,NaCl 1.5g/L,FeSO_40.5g/L;最佳发酵条件为转速190r/min,温度28℃,pH 7,接种量8%。在此条件下,发酵液恩拉霉素浓度达11 860μg/mL。     

橡实制备燃料乙醇菌种筛选及工艺考察

[目的]筛选适宜的橡实制备燃料乙醇的菌种,并优化该发酵工艺。[方法]以橡实粉为原料,筛选适宜的燃料乙醇发酵菌株,并对该工艺条件进行了优化。[结果]酿酒酵母FE-B是一株高效的耐受单宁中温菌株。以橡实粉制备燃料乙醇,当液化温度为95℃,乳液浓度为32%,液化pH为5.8,液化酶用量0.06%,糖化酶用量0.05%,发酵温度为36℃时,可获得较高产率的燃料乙醇。[结论]在纤维乙醇生产技术尚不成熟的前提条件下,为了发展非粮燃料乙醇,利用野生淀粉资源橡实发酵生产燃料乙醇是一种很好的选择。     

赭绿青霉 Sp1菌株木聚糖酶最佳产酶条件及部分酶学特性研究

[目的]从土壤中分离筛选获得了一株具有高产木聚糖酶能力的真菌Sp1.[方法]经过28S rDNA测序鉴定为赭绿青霉(Penicillium ochro-chloron ).通过对摇瓶发酵条件优化试验及酶特性研究.[结果]该菌株的最适产酶条件为:2;(W/V)粗制木聚糖+0.5;葡萄糖为碳源,0.44; KNO3+0.06;蛋白胨为氮源,发酵起始pH为5.0,150 mL三角瓶装液量为40 mL,转速为220 r/min,28 ℃下培养72 h木聚糖酶酶活可达387 U/mL.将菌株Sp1发酵所得粗酶液经过纯化后研究其酶学特性,酶最适反应pH为4.0,最适反应温度为55 ℃,在40 ℃,pH 2.2～6.0,酶活性稳定.终浓度为0.01 mol/L的Na+ 、K+ 和Zn2+ 对酶活有促进作用.[结论]所筛选的Sp1菌株具有较好的应用前景.