结球甘蓝抗虫转基因植株及其后代的抗性表现

应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因和新霉素磷酸转移酶 (NPTⅡ )基因的重组质粒导入结球甘蓝栽培品种春甘蓝“鸡心 2 3”和秋甘蓝“黑叶头”。对转基因当代植株 (T0 )及其自交后代 (T1、T2 、T3)群体进行卡那霉素抗性、抗虫性鉴定和分子检测。经PCR DNA分子杂交检测 ,确认抗虫基因———豇豆胰蛋白酶抑制剂基因已整合到受体植株的基因组中 ,并在有性生殖过程中传递给后代。卡那霉素抗性和抗虫性状在T0 代植株上得到表达 ;T1代植株中发生分离 ;T2 代中呈现出 3种不同类型的株系 :抗性纯合、杂合型和敏感性纯合株系 ;从T3 代中获得卡那霉素抗性和抗虫性纯合的株系。试验结果显示 ,卡那霉素抗性和抗虫性状在转基因植株自交后代中的表现基本符合显性单基因的分离规律。在T2 、T3 代抗虫性纯合的株系中 ,鳞翅目小菜蛾、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的 1～ 2龄幼虫校正死亡率为 6 %～ 10 0 % ,从中选出一批校正死亡率达 80 %左右的单株     

转CpTI基因不结球白菜的抗虫性表现

通过卡那霉素筛选、目的基因分子检测和生物学抗虫性鉴定 ,从转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因不结球白菜遗传工程植株自交后代中选育出抗虫性可遗传的纯合材料。用室内人工饲喂方法 ,以鳞翅目小菜蛾、斜纹夜蛾幼虫为靶害虫 ,对转基因植株进行抗虫性鉴定。试验结果显示 ,转CpTI基因纯合材料对 1～ 2龄小菜蛾和斜纹夜蛾幼虫具有抗性 ,但不同株系间和同一株系内植株间的抗虫性程度差异较大     

普通不结球白菜抗虫转基因植株的获得

以普通不结球白菜品种“中脚黑叶”和“矮脚黑叶”种子无菌苗的子叶为外植体材料,在附加２ｍｇ／Ｌ ＣＰＰＵ、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ和７．５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３的稍作修改的ＭＳ培养基上诱导不定芽,子叶（柄和子叶切段诱导不定芽频率分别为３２．５２％、４．３５％和４．７９％、１１．５５％。应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（ＣｐＴＩ）和新霉素磷酸转移酶基因（ＮＰＴⅡ）的重组质粒导入普通不结球白菜,获得具有卡那霉素抗性的再生植株。具有卡那霉素抗性的当代转基因植株（Ｔ０）及其自交后代（Ｔ１）植株经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子检测,确认抗虫基因已整合到受体植株的基因组中,并通过有性生殖遗传给后代。体外生物学测定结果,显示抗虫性在转基因植株自交后代植株中得到表达。     

不结球白菜子叶原生质体培养再生植株

用 1 0g/ 10 0mL纤维素酶 (OnozukaR 10 ) ,0 1g/ 10 0mL果胶酶 (MecerozymeR 10 )及 10mmol/LCaCl2 ·2H2 O ,0 7mmol/LKH2 PO4 和 0 5mol/L甘露醇的混合酶液 ,从 14～ 18d苗龄的不结球白菜子叶上分离出高产率的原生质体。原生质体培养在KM8P1附加 2 ,4 D 0 5mg/L、 6 BA 0 2 5mg/L、NAA 0 5mg/L、葡萄糖 9 0g/ 10 0mL、蔗糖 1 0g/ 10 0mL、半乳糖0 0 3g/ 10 0mL液体培养基上 ,分裂旺盛。形成愈伤组织后经芽诱导和生根培养 ,获得了再生植株。     

不结球白菜子叶离体培养再生植株

用矮脚黄的子叶建立了不结球白菜高频率再生体系。在ＭＳ＋６－ＢＡ１０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．３ｍｇ／Ｌ培养基上，外植体分化率达７０％，每一外植体可产生９．６个不定芽。研究了各种因素对子时离体再生植株的影响，发现１１～１５ｄ苗龄的子叶分化效果最佳。ＭＳ＋ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ对根的诱导最好。     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.     

镉在不结球白菜中的积累及外源脱落酸对镉积累的影响

采用溶液培养的方法,研究了镉(Cd)和脱落酸(ABA)对不结球白菜幼苗生长以及Cd积累的影响。结果表明,10μmol·L-1Cd处理显著抑制不结球白菜幼苗的干物质积累,降低不结球白菜叶片的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、PSⅡ最大光化学效率、PSⅡ光合电子传递量子效率、电子传递速率和光化学猝灭系数,增加不结球白菜叶片的非光化学猝灭系数。5μmol·L-1ABA处理对不结球白菜地上部干物质的积累及净光合速率没有显著影响,但降低了不结球白菜的根系干重、叶片的蒸腾速率和气孔导度。而在100μmol·L-1Cd胁迫下,外源ABA处理明显增加不结球白菜根系Cd含量,降低Cd向地上部的转运能力,降低不结球白菜地上部Cd含量。试验结果还显示:不结球白菜地上部Cd含量占总Cd含量的百分比与叶片蒸腾速率呈显著正相关。     

不结球白菜BrLOS2基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

利用RT-PCR和5'/3'RACE方法,从不结球白菜冷诱导12 h的根中,克隆到1个冷适应相关基因BrLOS2,GenBank登录号DQ334724,其cDNA全长1 666 bp,含有1 335 bp的完整开放阅读框,编码444个氨基酸.BrLOS2基因与芜菁、甘蓝型油菜、拟南芥等物种的烯醇酶基因有80%以上的同源性,有1个烯醇酶N端结构域、1个烯醇酶结构域和保守的DNA结合域.二级结构及三维结构分析表明,BrLOS2具有许多其他LOS家族的共同特性.     

小白菜线粒体DNA提取体系的建立

为了建立小白菜线粒体DNA(mtDNA)提取体系,以小白菜黄化苗为材料,研究了不同提取方法、材料选择等因素对线粒体DNA提取的影响。结果表明,经冰浴研磨小白菜黄化苗,通过简易的密度梯度离心技术快速抽提大量高纯度的线粒体,蛋白酶K裂解线粒体及有机溶剂抽提去除蛋白质,可获得纯度较高的mtDNA,能用于RAPD分析。     

白菜BcMF2基因在大肠杆菌中的高效表达

通过PCR方法扩增BcMF2cDNA完整的编码区序列,构建pETBcMF2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达;SDSPAGE电泳检测发现在70kD处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致,同时发现,其阳性克隆在30℃和IPTG终浓度为0.4～1.0mmol·L-1时诱导6h,均能获得较高的表达量。     

增强外源基因在转基因植物中表达的策略

在转基因研究和生产应用中,人们往往期待目的基因能在转基因生物中高效表达从而实现相关目的--获得具有对杀虫剂、除草剂高抗性的农作物,或以植物作为生物反应器生产具有高附加值的疫苗、抗生素等医药用品以及工业用蛋白、酶类等。综述了各种用于增强外源基因表达效率的策略,从外源基因的整合、转录水平的调节以及外源基因翻译后的蛋白分选三个水平阐述提高外源基因表达的相关策略的利弊,从而为转基因研究提表达供载体构建方面的参考依据。     

有性多倍化白菜四倍体雄性不育花药发育的解剖学研究

[目的]对有性多倍化雄性不育系花药的败育时期和方式进行研究,为雄性不育基础研究提供理论依据。[方法]以同源四倍体白菜为母本,以秋水仙素诱导筛选出含2n配子较高的二倍体为父本杂交获得四倍体不育系及其保持系为材料,采用常规石蜡切片法对其花药进行解剖学研究,观察其花药的败育时期。[结果]退化的雄蕊可分为4种类型,均败育于孢原细胞分化期,始终处在孢原细胞期,无绒毡层与花粉母细胞的分化,不形成药室,属孢子体败育型。[结论]有性多倍化白菜四倍体雄性不育的4种类型都是孢子体败育型。     

生物有机肥在小白菜上的应用效果

为了验证生物有机肥在小白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)上的应用效果,开展了肥效试验。结果表明,生物有机肥可以使小白菜株高增加,叶片增大,单株鲜重提高,并可显著提高产量。     

白菜核雄性不育两用系AFLP扩增特异片段的克隆及序列分析

利用AFLP技术从白菜核不育两用系"矮脚黄"可育系DNA中得到一个特异扩增片段MF-14.Southern杂交结果证实不育系也存在该片段的同源序列;回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM-T Easy载体进行序列测定.测序结果表明,该片段全长289 bp,其碱基组成为A+T=46.02% .与白菜RAPD特异片段S107及其他育性相关基因核苷酸序列比较,同源性均低于50% .表明该片段为一新的序列.     

不结球白菜苏州青子叶离体分化

以不结球白菜品种苏州青的子叶为外植体 ,研究了苗龄、培养基、生长调节剂与硝酸银浓度等因子对其不定芽分化频率的影响。结果表明 ,在MN +TDZ (2mg·L-1) +NAA (0 5mg·L-1)条件下 ,苏州青的子叶分化率最高 ,达36 7% ;最佳苗龄为 7d ;硝酸银的最佳质量浓度为 7 5mg·L-1。     

不结球白菜小孢子胚胎发生过程及发育途径研究

采用FDA荧光染色法对小孢子游离培养的发育过程进行了观察。结果表明:不结球白菜花粉母细胞减数分裂释放出的小孢子发育到单核靠边期及稍后时期染色最深、活力最强。多数游离小孢子培养经历的发育过程与合子胚相似,并且胚胎发育迅速,6～9 d产生大量球型胚,13 d开始出现子叶型胚胎。小孢子胚胎发育途径既有对称分裂并产生胚胎的途径(B途径),也有第1次不对称有丝分裂的方式;第1次不对称分裂后,既有营养细胞单独发育成胚的现象(A途径),也有营养细胞和生殖细胞共同发育成胚的现象(E途径),但未发现生殖细胞单独发育成胚的现象。     

不结球白菜抗根肿病遗传规律和分子标记

[目的]探讨不结球白菜根肿病抗性的遗传规律。[方法]该研究利用引进的结球白菜与不结球白菜进行杂交,以双亲、F1、F2和BC14个世代联合群体为试材,采用苗期接种鉴定法进行抗性鉴定,并进行 ISSR分子标记筛选。[结果]不结球白菜根肿病抗性受1对显性基因控制。利用ISSR分子标记结合 BSA法获得了与不结球白菜根肿病抗性连锁的分子标记,命名为CR-873。该标记与抗性基因间的连锁遗传距离为9.72 cM。[结论]研究结果可为不结球白菜分子标记辅助育种奠定基础。