陆地棉GhPLDα基因的克隆、序列分析及表达

【目的】棉花磷脂酶D(GhPLDα)基因的克隆、序列功能结构域分析及表达。【方法】以陆地棉胚珠和纤维为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,利用分光光度法检测酶活性,采取RT-PCR方法检测基因表达。【结果】从发育的棉花胚珠和纤维混合材料中克隆得到的磷脂酶基因的开放读码框为2 421 bp,编码包含807个氨基酸的蛋白质,分子量约为88 kDa。通过同源序列比对和功能结构域分析,GhPLDα具有典型的磷脂酶D家族(HKD)结构域,同时还存在蛋白激酶C结构域2(C2结构域)。构建了pET28a-GhPLDα原核表达载体;获得分子量约为88 kDa左右的重组蛋白GhPLDα。半定量RT-PCR结果表明GhPLDα基因可能参与棉花胚珠与纤维发育过程。【结论】GhPLDα基因的克隆、序列分析和表达为进一步研究棉花GhPLDα基因在胚珠和纤维发育中过程的功能奠定了基础。     

猪Ob-Rb基因的克隆与分析

[目的]采用RT-PCR法克隆与分析瘦素受体06-Rb cDNA序列。[方法]从160日龄初情期的苏姜猪的下丘脑中提取组织总RNA．根据GenBank中猪06．RbmRNA全序列设计引物，用反转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）进行cDNA扩增，获得1条343bp的片段，将PCR产物克隆于pGEM—Teasy载体后进行测序分析。[结果]用紫外分光光度计检测所提取的RNA质量，0D260／OD280=1.9，证明所提RNA的质量较好，无降解和蛋白质污染；用1％的琼脂糖检测所提RNA，有3条清晰的条带，分别是28S、18S、5S，28S与18S浓度比约为2：1．说明所提的RNA的完整性较好。所获D6-RbcDNA序列用Blast程序与在GenBank中发表的猪06-Rb cDNA序列（AF092422）比较表明，其同源性为100％，说明所扩增的序列是正确的。[结论]该研究为进一步探索Ob-Rb基因组织表达和作用机理奠定了理论基础。     

白菜总RNA的高效提取方法及常见问题分析

[目的]建立从白菜叶片组织中快速提取高质量RNA的方法，为进行LD—PCR、AnP、SRAP及其他分子生物学试验奠定基础。[方法]通过增加高速离心时间，用3％H2O2处理试验器皿等措施对Trizol试剂法进行优化，建立了一种简单、快捷、经济、高效的RNA提取方法。[结果]在1．5h左右可得到高质量的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳、蛋白核酸分析仪检测，提取的总RNA具有清晰的28S、18S、5S3条带，且28S的宽度是18S的2倍左右，0D260／DD280比值为1．90—2．16。进一步以提取的总RNA为模板成功进行了单链cDNA的合成和LD—PCR。[结论]改良的Trizol试剂法所提取的RNA纯度和完整度极高，可用于LD—PCR、SRAP、基因克隆及表达分析等后续分子生物学试验。     

一种简单高效提取棉花不同组织总RNA的方法

目前,虽然已经报道了几种比较有效的提取棉花组织总RNA的方法,但是这些方法往往费时费工,又很难同时适用于棉花不同组织的总RNA提取。以CTAB法为基础进行技术改良,同时结合LiCl沉淀等,总结出了一种简单、快速又普遍适用于棉花各组织总RNA的提取方法。试验证明,此法提取到的RNA纯度高、完整性好,适用于逆转录合成cDNA第一链、RT-PCR分析以及Northern杂交等分子实验。     

鸡催乳素受体胞外域的分子克隆及原核表达

根据家鸡催乳素受体基因胞外域序列（GenBank号：D13154）设计并合成1对覆盖编码区58～1249位核苷酸的引物，以家鸡垂体总RNA为模板，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片断，将该片断克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌Ecoli DH5α永久保存．通过设计第2对引物扩增PRLR胞外域cDNA片段，该片段经酶切后克隆到表达载体pRSETA的EcoRⅠ和HindⅢ两酶切位点之间，构建重组质粒pR-PRLR．该质粒在转化感受态细菌E．coli B121（DF．3）后，在IPTG诱导下促使重组菌表达了相对分子质量为53640左右的重组融合蛋白，表达量在0．1mmol／L IPTG诱导5h时达到最高，约占总菌体蛋白的17．6％左右．表达产物可经体积分数为50％的Ni-NTA凝胶纯化，说明重组蛋白中具有正确的His-tag标签及之后的鸡催乳素受体编码区胞外域序列．     

青梅果超氧化物歧化酶粗酶的提取及活性研究

[目的]测定青梅果超氧化物歧化酶（SOD）活性，筛选青梅果SOD粗酶提取最有效的方法。[方法]以重庆綦江青梅果为原料，采取不同料液比提取青梅SOD粗酶，以Sevage法除去杂蛋白，硫酸铵分级沉淀。同时对各步骤所得S0D粗酶活性、蛋白量、比活的检测结果进行比较。[结果]H3P04缓冲液的用量对SOD粗酶的提取有直接影响。当H3PO4缓冲液与梅果的比例为3：1时，测得酶的比活最高，为25．34U／mg蛋白；粗酶液按3：1体积比加入的氯仿-乙醇混合液除去杂蛋白效果明显；粗酶液添加（NH4）2SO4至90％饱和度沉淀SOD效果好，比活较提取液上升51．43U／mg蛋白。[结论]青梅果SOD粗酶提取的最佳条件：H3PO4缓冲液与青梅比例为3：1，温度为25～30℃，pH值为7．8，Sevage法除去杂蛋白，（NH4）2SO4盐析从35％添加至90％饱和度沉淀SOD。该条件下，总蛋白为215．13mg，酶总活力为5415．74U／mg蛋白，比活为25．34U／mg蛋白。     

草坪植物RNA提取方法的比较研究

用CTAB法、SDS法、快速SDS法、异硫氰酸胍法、Tris-硼酸法和Trizol一步法等6种方法．分别从草坪植物草地早熟禾（Poapratensis L．）、高羊茅（Festuca arundinacea Schreb．）以及马蹄金（Dichondra repens Forst．）叶片中提取总RNA．并比较各种方法提取RNA的质量。结果表明，由异硫氰酸胍法、SDS法和Tris-硼酸法3种方法获得的RNA纯度较低，存在降解和弥散现象，或混杂的DNA、蛋白质较多，效果均不理想；而用CTAB法、快速SDS法和Trizol试剂盒提取的RNA很少有降解．所得的28SrRNA和18SrRNA条带十分清晰．且D260／D280在1．871至2．021之间。快速SDS法是一种从草坪植物中有效提取高质量RNA的方法．在完整性、纯度、产率上均优于其他几种方法。     

一种自制的RNA分离试剂及其在鱼组织总RNA提取中的应用

【目的】尝试自制一种价格低廉的RNA分离试剂,并检验其应用效果。【方法】以商业化的TRizol Reagent为对照,使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA,采用分光光度计法、变性琼脂糖凝胶电泳法和RT-PCR检测其品质,并用提取的总RNA合成草鱼皮肤cDNA。同时使用自制RNA分离试剂提取斑马鱼总RNA,通过RT-PCR进行E2F5基因全长（1 092 bp）的克隆,构建其真核和酵母表达载体并测序。【结果】使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA的品质与用TRizol Reagent提取的总RNA品质相当,用之成功地合成了草鱼皮肤cDNA。使用自制RNA分离试剂提取得到了更高品质的斑马鱼总RNA,用之成功地克隆了斑马鱼E2F5基因,构建了其真核表达载体pcDNA3.1-flag-Zf E2F5和酵母表达载体pGAD GH-Zf E2F5。【结论】自制RNA分离试剂能够用于鱼类组织总RNA的提取,提取的总RNA能满足后续cDNA合成及RT-PCR克隆特定基因的需要。     

大丽轮枝菌毒素诱导表达陆地棉cDNA序列的克隆与定位

 为获得陆地棉黄萎病抗性相关候选基因，利用棉花黄萎病菌大丽轮枝菌V991毒素粗提物诱导耐黄萎病陆地棉品种'中棉12'应激基因的表达。在诱导幼根24 h时间点提取总RNA，PCR法合成双链cDNA，应用抑制消减杂交技术[1]，得到了差异表达的180个克隆。经反Northern blot筛选出15个受毒素粗提物诱导应激表达的阳性cDNA克隆，将其命名为Vdrg（response gene induced by toxin of Verticillium dahliae）。本研究对所得阳性cDNA克隆进行了序列分析，并利用Pima S6 与 Acala Maxxa 海陆杂交四倍体棉花F2群体对Vdrg序列进行了棉花基因组定位。     

滴灌条件下棉花不同生育期N·P配比施肥研究

[目的]寻求滴灌棉花不同生育期N、P肥配比的最佳施肥方案。[方法]在有机质含量较低、肥力中下、有效氮较贫的新疆垦区土壤上，应用6因子2次正交旋转组合设计，研究滴灌条件下随水施肥棉花不同生育期（苗蕾期、花铃前期、花铃后期）养分需求规律、N和P肥的最佳用量。[结果]在该试验土壤条件下，棉花各生育期施氮肥对棉花的增产效果非常明显，而磷肥仅在吸收较强的花铃后期表现出一定的增产作用。籽棉产量高于4500kg／hm^2的各生育期N、P配比的优化施肥方案依次是：苗蕾期氮（N2）90．93～97．44kg／hm^2，磷（P2O5）15．53～19．44kg／hm^2；花铃前期氮（N2）163．31～168．08kg／hm^2，磷（P2O5）27．84～30．77kg／hm^2;花铃后期氮（N2）41．37～45．71kg／hm^2，磷（P2O5）66．96～72．65kg／hm^2。[结论]该研究为确定棉花滴灌专用肥的配方及科学施用提供依据。