石蒜捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的克隆和序列分析

根据捕光叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)家族中的保守序列设计PCR引物,扩增出的约350bp cDNA小片段为分子杂交探针,对构建的石蒜全长cDNA文库进行杂交筛选,并结合PCR分析对阳性克隆进行测序分析验证,克隆了石蒜中1个Cab基因全长cDNA,命名为LrCab(GenBank 登记号:GU362887).LrCab长为1073 bp,从第50 bp开始至847bp含有1个开放阅读框和1个终止密码子,编码 265个氨基酸.LrCab编码的蛋白质预测的等电点和分子量分别为5.14和28 010.00 u.通过比较分析,LrCab DNA序列(GU362887)和编码的氨基酸序列与其他种属的Cab基因编码氨基酸序列相似性很高,表明Cab家族基因在进化过程中保守性高.     

棉花解旋酶基因克隆及生物信息学分析

从棉花cDNA文库中克隆了棉花解旋酶全长基因,GenBank登记号:EU373038,并对其编码的氨基酸序列进行分析.结果显示,基因长度为3 491 bp,编码930个氨基酸,其编码的蛋白质预测等电点和分子质量分别为5.98和103.994 ku.蛋白质氨基酸序列分析表明,所获得的基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中拟南芥同源性为74%与水稻同源性为60%,与葡萄同源性为79%.     

棉纤维特异表达蓝铜蛋白基因(GhBCP1)的克隆与鉴定

【目的】对从棉纤维细胞分离获得的基因GhBCP1进行序列和表达分析,初步分析其功能。【方法】采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术克隆基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhBCP1(GenBank登录号:EF222282),该cDNA全长721bp,含有一个编码176个氨基酸蛋白的开放阅读框。BLAST分析表明该基因所编码产物为一个蓝铜蛋白。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsytum L.)中有2个拷贝。实时荧光定量PCR分析发现该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhBCP1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育由伸长向次生壁合成转换阶段。【结论】GhBCP1基因的组织特异性和发育阶段性表达初步证明该基因的功能可能与次生壁合成的起始密切相关。     

一个棉花锌结合蛋白质(ZnBP)基因的克隆及原核表达

为了解棉花锌结合蛋白的理化性质及结构特征,从已构建完成的棉花(湘棉18)腺体形成时期的cD-NA均一化文库中筛选出1个棉花锌结合蛋白质(Zinc binding protein,ZnBP)基因的全长cDNA序列。经过克隆、测序及序列分析,发现该片段包含1个完整开放阅读框,长654个碱基,编码217个氨基酸,蛋白质分子量为2.46×104,等电点为9.33。以湘棉18叶片DNA为模板,通过PCR扩增分离获得棉花ZnBP基因。经测序拼接,得到1 731 bp的棉花gDNA片段,编码区含有3个内含子。利用pET-28a(+)载体,开展了该基因的原核表达研究,在37℃、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)终浓度1 mmol/L、诱导时间8 h和转速150 r/min条件下,实现最优表达;SDS-PAGE凝胶电泳及Western blotting检测分析结果表明,蛋白表达正确。     

当归甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及组织稳定性分析

通过同源比对查找GAPDH基因的保守区,运用逆转录PCR、同源克隆及cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)等技术从当归中克隆GAPDH基因的全长cDNA序列,利用生物信息学分析工具对该基因编码蛋白的基本性质、结构特点及生物学功能进行初步预测,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析当归GAPDH基因的表达稳定性。结果表明,克隆得到当归GAPDH基因cDNA全长序列为1 345个核苷酸,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 005 bp,3’UTR和5’UTR长度分别为268 bp和72 bp,共编码334个氨基酸,该基因命名为AsGAPDH。AsGAPDH基因编码蛋白的预测相对分子质量为36.3 kD,理论等电点为7.06,为亲水性非分泌型蛋白,与伞形科植物白芹的亲缘关系最近。AsGAPDH基因在当归根、叶柄及叶中的表达量相近且稳定性好,扩增特异性强。     

刺五加GAPDH 基因全长cDNA 的克隆与生物信息学分析

采用cDNA末端RACE技术,从刺五加叶片中克隆到GAPDH基因cDNA的全长序列,并运用生物信息学方法对该基因的cDNA序列、保守区、氨基酸序列、亲缘关系等特征进行分析,并预测其编码蛋白质的结构和功能.研究结果表明,刺五加GA PGH基因的cDNA全长为1 437 bp,开放阅读框全长为1 023 bp,编码一个具有340个氨基酸残基的蛋白,蛋白分子质量为37.070 ku,理论等电点(pI)为7.71.刺五加GAPDH蛋白不存在跨膜结构域,定位于细胞质中,属于亲水蛋白.     

牛PS ME1基因的电子克隆与序列分析

电子克隆是基因克隆的新策略.以人类PSME1基因完整编码序列(NM_006263)为种子序列电子克隆了牛PSME1基因完整编码序列.以奶牛外周血白细胞cDNA为模板,根据电子克隆序列设计引物进行RT-PCR验证,PCR产物克隆入质粒载体,阳性克隆测序得到的序列与电子克隆序列一致,已被GenBank收录,序列号为DQ010410.该基因最大开放阅读框34~783 bp,编码249个氨基酸,预测其编码的蛋白分子量为28.66 kD,等电点5.87.     

一个亚洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析

【目的】克隆亚洲棉MYB家族的一个新基因（GaMYB2）,研究其表达模式,分析其预期编码蛋白。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆亚洲棉MYB2的cDNA序列全长;应用生物信息学软件分析该基因及预期编码蛋白的特征;采用实时荧光定量PCR技术对该基因的组织特异性和PEG6000模拟干旱胁迫处理下的表达模式进行分析。【结果】从亚洲棉(Gossypium arboreum L.)中克隆了MYB家族的一个新基因MYB2,该基因全长1 117 bp,ORF全长840 bp,编码279个氨基酸,含有MYB保守域,氨基酸的BALSTP分析表明GaMYB2氨基酸序列与已报道的水稻（BAA23338.1）、小麦(AAT37168.1)等的序列有40.50%到68.20%的相似性。亚细胞定位表明该基因在细胞核中表达,实时荧光定量PCR结果表明该基因在根和花中的表达量较高,并且响应17%的PEG6000模拟干旱胁迫处理,上调表达。【结论】GaMYB2是亚洲棉MYB家族的一个新基因,并认为该基因可能在棉花调控干旱胁迫的生理适应过程中发挥重要作用。     

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。     

海岛棉一个成花素类似基因的克隆和生物信息学分析

[目的]海岛棉成花素类似基因的克隆及生物信息学分析.[方法]利用RT - PCR技术,从海岛棉中克隆成花素FLOWERING LOCUST(FT)的同源基因,并进行生物信息学分析.[结果]从新海14号花后15 d纤维中,克隆到一个棉花成花素类似基因FLOWERING LOCUS T- LIKE1,命名为GbFTL1.该基因的开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸.蛋白比对表明bFTL1和AtFT的相似性为79.3;,和陆地棉GhFTL1的相似性为99.4;,GbFTL1第37位氨基酸为Asn(N),而GhFTL1第37位氨基酸为Ser(S).GbFTL1含有FT蛋白亚家族两个关键的氨基酸残基及14个保守氨基酸,系统进化树分析表明GbFTL1属于FT亚家族成员.[结论]GbFTL1基因可能为海岛棉中促进开花的基因之一.     

甘蓝型油菜种子不同发育期基因差异表达cDNA文库构建

以授粉后27 d的种子mRNA为目标群体,授粉后7 d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2 %,片段大小200～600 bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性.     

玉米sbe2a基因RNAi载体的构建及转化玉米的初步研究

采用PCR技术克隆了玉米淀粉分支酶sbe2a基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并进行序列分析.结果表明:克隆片段长度为562bp,将该基因的正义和反义片段插入到pCAMBIA1301改造过的载体p35-1301的35S启动子下游,构建高效RNAi表达载体,通过花...     

二斑叶螨cDNA文库的构建及鉴定

为研究二斑叶螨发育相关基因的功能,利用TRIzol试剂提取二斑叶螨总RNA,通过SMART技术构建cDNA文库.利用SMART IVTM Oligonucleotide和CDSIII/3忆PCR Primer为引物,在反转录酶作用下,合成cDNA第1链,利用LD-PCR方法合成cDNA第2链。合成的双链cDNA经酶切回收后,再连接pDNR-LIB载体,转化大肠杆菌感受态细胞Trans5琢,检验库容量和重组效率,并采用PCR方法检测插入cDNA片段的大小.结果表明,构建的二斑叶螨cDNA文库的库容量为3.54C6 CFU/mL,重组效率达95.8%,插入片段长度在0.3~2.0 kb之间。构建的二斑叶螨cDNA文库质量良好袁能够为进一步研究二斑叶螨基因的功能奠定基础。     

玉米淀粉分支酶sbe2a基因反义载体的构建及其转基因初步研究

应用PCR技术克隆了玉米淀粉分支酶sbe2a基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PER检测和限制性内切酶分析,并进行序列比对.结果表明:克隆片段长度为562 bp.将该基因反向插入到pWGLL载体Aetin-pro启动子下游,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系"铁7922",经PCR检测初步证明外源基因已整合到玉米基因组中.     

花生种仁特异表达基因的初步筛选

应用抑制消减杂交技术,以花生种仁cDNA作为消减杂交的试验方(tester),以花生果皮cDNA作为驱动方(driver)进行消减杂交。经过两轮抑制PCR后,将第2次PCR产物与pGEM-TEasy载体相连,电击转化大肠杆菌,成功构建种仁特异表达cDNA文库。所长出菌落中91.2%为白色克隆,采用PCR法对阳性克隆进行鉴定,发现其中单一扩增条带的克隆约占86.5%,片段大小集中分布于200～800 bp之间。用花生种仁cDNA探针和果皮cDNA探针分别对文库高密度杂交点阵膜进行反向Northern杂交检测。根据杂交结果,初步从文库中挑取出254个差异点。花生种仁特异表达基因的初步筛选,为了解花生产量、品质形成相关的重要功能基因,也为将来应用植物基因工程手段改良花生产量和品质奠定基础。     

苹果周期蛋白依赖性蛋白激酶亚基基因MdCKS表达载体的构建

根据GenBank上与周期蛋白依赖性蛋白激酶基因相关序列,从苹果MdCKS基因编码区设计带有XbaI和SalI酶切位点的引物。以富士MdCKS基因的eDNA为模板将PCR扩增片段连接到pMD18-TSim-pieVector上,测序正确后,再连接到植物表达载体pBII21上,经过抗性筛选和测序验证,成功构建了MdCKS基因表达载体。并通过电击转化法导入农杆菌LBA4404,以备将来用于番茄转化。     

粟酒裂殖酵母mae1基因的克隆及其在产朊假丝酵母中的整合表达

以粟酒裂殖酵母基因组DNA为模版,逆转录获得cDNA;以cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增,得到苹果酸通透酶(mae1)基因,将其与pMD-18T连接并测序.结果表明cDNA全长为1316 bp,编码438氨基酸,分子质量49ku,与已报道的mae1基因序列的同源性达到99％.mae1与整合型表达质粒...     

东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建

为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列,采用SMART技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库.用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取总RNA,以逆转录酶PowerScriptTM 反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA.扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E. coli DH5α内得到原始文库.经测定,构建的原始文库约含有2.56×10~6个重组子,插入片段多在0.5～2kb之间,平均插入片段长度约1.1kb,重组效率接近100%.结果表明,东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库已构建成功.     

掌叶半夏凝集素基因表达载体的构建与鉴定

从掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)块茎中提取总RNA,反转录合成cDNA.根据GenBank中已报道的天南星科凝集素基因序列,设计带有酶切位点的表达引物,用RT-PCR方法扩增出掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)基因.PPA经双酶切后与表达载体pGEX-6P-3连接,构建pGEX-PPA重组表达载体.通过PCR、双酶切及测序鉴定,结果表明,重组载体pGEX-PPA构建成功,为进一步进行PPA的原核表达及其功能研究奠定了基础.     

芪合酶基因的克隆及其酵母表达载体的构建

应用基因工程技术将从中国野生属葡萄种高抗白粉病的华东葡萄白河-35-1中分离出的芪合酶基因cDNA片段（Stilbene synthase，STS）进行PCR扩增；把回收的目的基因PCR产物定向插入克隆载体pGEM-TEasy中进行测序与序列分析；采用定向克隆的方法将芪合酶基因克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭型酿酒酵母表达载体pYES6／CT上，转化大肠杆菌，提取阳性重组质粒转化酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌株INVScl，酵母菌落PCR电泳结果显示，在约1200bp处有一条亮带，证明芪合酶基因酵母表达载体构建成功，为后期工作的开展奠定了基础，并为开发一种含有白藜芦醇生物活性成分的酵母微生态制剂提供了重要的实验素材。