濒危植物珙桐ISSR-PCR反应体系的建立

以珙桐叶片为材料,通过单因子试验分别研究了退火温度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2 浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,建立了适宜于珙桐ISSR分析的扩增体系,即25μl的反应体系中:模板DNA20 ng,Mg2 1.5 mmol/L,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U。     

山核桃SSR反应体系优化

优化SSR反应体系是山核桃SSR遗传图谱构建的基础.通过对PCR反应中Taq聚合酶用量、dNTP浓度、引物浓度、Mg2 浓度和模板DNA量的组合试验,确定了山核桃SSR的最佳反应体系,即在30μL反应体系中,含600 ng模板DNA,1×PCR Buffer,2.0UTaq聚合酶,0.22mmol/L dNTP,1.0 mmol/L Mg2 ,0.13μmol/L引物.     

茶树ISSR-PCR反应体系的正交优化

对茶树ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶浓度(U/(20μL))、Mg2+浓度(mmol/L)、模板DNA质量浓度(ng/(20μL))、dNTP浓度(mmol/L)、引物浓度(μmol/L))在4水平上进行正交优化试验,筛选出各因素的最佳水平,建立茶树最佳ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶为1.0U/(20μL),Mg2+为2.0mmol/L,模板为40ng/(20μL),dNTP为0.20mmol/L,引物为0.25μmol/L.对茶树ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,确定引物ISSR1、UBC881的最适退火温度分别为52.4、59.0℃.     

越橘SSR反应体系的优化

以"美登"、"北春"、"蓝丰"为试材,用TIANGEN植物基因组试剂盒提取基因组DNA,对SSR反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物浓度、DNA模板浓度以及引物CA344F的退火温度进行了优化筛选,探讨了越橘SSR技术中PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响.确定了适合越橘的SSR反应体系:在20μL反应体系中,Mg2+2.0 mmol/L,dNTPs 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶0.5 U,引物浓度0.8μmol/L,DNA模板1.5ng/μL;引物CA344F的最佳退火温度为58℃.利用此反应体系对部分越橘品种进行PCR扩增并用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,扩增结果清晰且DNA谱带多态性丰富,表明该体系稳定可靠,适合越橘的亲缘关系分析.     

葛属植物ISSR-PCR扩增条件的正交优化

利用正交试验设计法L9(34),从引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度和dNTP浓度4种因素3个水平,对葛资源ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对PCR反应的退火温度进行梯度筛选。结果表明,25μL最佳的葛资源ISSR-PCR反应体系是:1×PCR buffer、0.20 mmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、2.5 mmol/L Mg2+和0.5 U TaqDNA聚合酶,引物UBC809的最佳退火温度为57.9℃。     

利用正交设计法优化观赏贝母ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计的方法,对观赏贝母ISSR-PCR反应体系的5因素(模板DNA、引物、Mg<'2+>、dNTP、TaqDNA聚合酶的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用Mnitab数据处理软件分析,建立的最佳反应体系(20 μL)为:模板DNA 10 ng、引物0.5μmoL/L、Mg<'2+> 2.5 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、Taq DNA聚合酶2.0 U.对观赏贝母IS-SR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火试验,得到的最佳退火温度为57.9℃.     

梨SSR反应体系的优化

为了丰富梨分子遗传图谱的SSR标记,以鸭梨、京白梨及鸭梨×京白梨的实生后代为试材,对影响梨SSR技术PCR反应体系中的模板DNA用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量以及每对引物的退火温度进行了探索,确立了适宜梨的SSR反应体系,即在20 μL反应体系中, 模板DNA用量为30 ng,Mg2+、dNTP和引物的最适浓度分别为1.2 mmol/L、0.15 mmol/L、0.8 μmol/L.Taq DNA聚合酶的最适用量是1.0 U.最后利用该反应体系筛选出了19个适宜梨遗传分析的SSR引物,引物的最佳退火温度为49～55℃,通过8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测,表明该反应体系扩增的多态性条带清晰稳定可靠.     

黄花苜蓿SSR-PCR反应体系的优化

对黄花苜蓿SSR-PCR扩增体系的反应条件进行了优化,分析了Mg2+浓度、dNTP浓度、DNA模板浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度对PCR扩增结果的影响.结果表明:在25μL的反应体系中,dNTPs的最佳浓度为0.2mmol/L,Mgcl2的最佳浓度为2.0mmol/L,DNA模版最适加入量80ng,引物的最佳浓度为0.16gmol/L,TaqDNA聚合酶的最佳用量为1U.     

云南松胚乳DNA提取与ISSR-PCR反应体系的建立

以云南松胚乳为试验材料,用改进的SDS法进行DNA的提取,并对其纯度、浓度及产率进行检测,结果表明：DNA扩增效果良好,完全能满足进一步试验的需要 采用单因子试验分析法分别研究模板DNA浓度、引物浓度、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、退火温度对反应体系的影响,建立并优化云南松ISSR-PCR 20μL反应体系：buffer（10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100 pH 9.0）,0.3μmol/L引物,1.5 m mol/L MgCl2,0.5 U TaqDNA聚合酶,0.2 mmol/L dNTPs,30 ng模板DNA,引物（GA）8的最适退火温度为52.5℃。     

苔藓植物SRAP反应体系的优化

以黄灰藓总DNA为材料,对影响SRAP-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等因素进行了优化,分析了各因素对SRAP-PCR扩增结果的影响。结果表明,在25μLSRAP-PCR反应体系中,最佳反应条件为:模板DNA40ng;Mg2+浓度2.0mmol/L;dNTP浓度0.2mmol/L;正反引物15pmol;TaqDNA聚合酶2.0U。在此条件下,引物组合Me5/em7对13种苔藓植物扩增的条带清晰、多态性好,表明此反应条件适合于苔藓植物的SRAP-PCR反应体系。