小麦叶锈菌与TcLr19非亲和互作cDNA文库的EST分析

 【目的】建立小麦叶锈菌与小麦非亲和互作的基因表达数据库,为从分子水平阐明小麦抗叶锈病机制奠定基础。【方法】对叶锈菌诱导的TcLr19小麦叶片cDNA文库随机测序,利用BLASTx对所得序列进行功能注释,按照Bevan的植物基因功能分类标准进行分类。采用RT-PCR技术,以Actin为参照,对2条信号转导相关基因和3条抗病与防御相关基因进行表达分析。【结果】随机对cDNA文库中756个阳性克隆测序,获得649条高质量EST。对EST序列聚类拼接获得472条非重复序列(Unisequence)。功能分类结果表明,25.2%为未知功能蛋白,21.0%与能量代谢基因相关,17.8%与抗病防御基因及信号转导基因相关,其余EST分别与转录、转运、蛋白代谢等功能基因相关。RT-PCR分析结果表明同一基因在叶锈菌侵染后不同时间点的小麦叶片中表达量不一致,且各基因有不同的表达模式。【结论】推测钙转运ATP酶,谷胱甘肽-S-转移酶,蛋白激酶Pti1,NBS-LRR抗病蛋白和分子伴侣DnaJ等参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。该cDNA文库可用于了解小麦与叶锈菌非亲和互作过程中的功能基因,为建立研究病原菌基因及小麦抗病基因数据库奠定基础。     

小麦与条锈菌非亲和互作的cDNA文库构建及表达序列标签分析

 【目的】了解小麦受条锈菌诱导后的基因表达情况，从分子水平揭示寄主与病原菌非亲和互作机理。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌CY23号小种组成的非亲和组合为材料，利用SMART技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。随机挑取克隆测序，对其中获得的507条高质量表达序列标签（EST）进行生物信息学分析。【结果】得到原始文库的滴度为1.2×106 pfu•ml-1，扩增文库滴度2×109 pfu•ml-1，重组率97%，插入片段大小为0.4～3 kb。对获得的237个非重复序列进行BLAST分析，已知功能基因大部分与能量代谢、蛋白质合成修饰及 加工、转运、信号转导、防卫反应等相关。【结论】该cDNA文库质量较高，信息丰富，获得的已知功能基因中能量和代谢相关约占40%，抗病与防御相关约占17.1%，这些信息有利于在分子水平上研究小麦与条锈菌互作机制，为进一步克隆小麦与条锈菌互作中的相关重要基因及功能分析奠定基础。     

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究大豆抗疫霉根腐病的分子机制

文章以中国优良大豆品种东农46及大豆疫霉优势生理小种1号菌株为材料,利用mRNA差异显示技术研究东农46与大豆疫霉根腐病菌非亲和互作中前后基因表达的差异,寻找并分离出与大豆疫霉根腐病抗病性相关的9条cDNA片段,通过这些差异片段的序列分析进一步阐述大豆对疫霉根腐病菌的分子抗病机制。     

西瓜抗枯萎病相关基因ClMYB转录因子的克隆及表达分析

【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因CIMYB转录因子,进行生物信息学及表达模式分析,为进一步解析CIMYB在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和Microarray数据分析,获得与西瓜抗枯萎病相关的基因CIMYB,采用RT-PCR技术分离克隆CIMYB c DNA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征;使用MEGA5.0对CIMYB蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;采用GFP标记的方法进行亚细胞定位,分析编码蛋白表达位置;将该基因片段通过Nde I和Xba I双酶切连接至原核表达载体p Czn1,重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express,经终浓度为0.5 mmol·L~(-1) IPTG诱导4 h,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在西瓜与枯萎病菌互作中及在茉莉酸(jasmonate,JA)诱导下的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从西瓜野生材料PI296341-FR根系组织中克隆该基因片段(Gen Bank:KT751229),序列比对及生物信息学分析表明,其基因编码的氨基酸序列具有MYB转录因子R2R3型的典型特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,C端高度变异。多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与甜瓜MYB(Gen Bank:XM_008440304)和黄瓜MYB(Gen Bank:XM_011652633)同源性最高,其编码的氨基酸一致性达到86%,这与它们同属葫芦科植物有关;亚细胞定位显示CIMYB定位于细胞核,为典型的转录因子;成功构建了该基因的原核表达载体p Czn1-CIMYB,转化至大肠杆菌得到36 k D左右蛋白;CIMYB受枯萎病菌诱导,在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中,相对感病品种表达量高峰出现的早,且表达量高。50μmol·L~(-1)的Me JA处理可以显著提高感病材料Black diamond对枯萎病的抗病水平,同时诱导CIMYB表达,与抗病材料PI296341-FR相比表达趋势一致,但表达量更高。【结论】CIMYB为典型的R2R3-MYB转录因子,亚细胞定位于细胞核中;基因的原核表达得到36 k D的融合蛋白,在西瓜中的表达受枯萎病菌和茉莉酸诱导,推测CIMYB可能参与JA介导的西瓜抗枯萎病防卫反应的信号通路,在西瓜抗病中起一定的作用。     

受条斑病菌侵染的水稻cDNA文库构建

提取经条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)侵染诱导后的水稻mRNA,利用SMARTTM技术于载体pGADT7-SfiAB上构建了水稻cDNA文库.检测发现,文库中含有水稻病程相关蛋白基因OsPR-1a、OsPR-1b和PAL.随机提取cDNA文库克隆的质粒,酶切分析发现,该cDNA文库的插入片段分布在500～2 000 bp之间,平均大小约为1 kb,重组率达95%.上述结果表明,水稻受条斑病菌侵染的cDNA文库质量较好,这为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定了工作基础.     

西瓜类甜蛋白家族全基因组鉴定及表达

【目的】对西瓜类甜蛋白家族基因（ClTLP）进行全基因组鉴定和序列特征及聚类分析,研究其在西瓜不同组织及病原菌胁迫下的表达模式,为进一步开展类甜蛋白家族基因的功能鉴定及其与枯萎病菌互作机制研究奠定基础。【方法】利用生物学软件对ClTLP进行序列特征及聚类分析,采用qRT-PCR技术检测ClTLP基因在西瓜根、茎、叶组织及枯萎病菌侵染不同时间（0,12,24,48,120,168 h）后的表达情况。【结果】从西瓜基因组中共鉴定到28个西瓜TLP家族基因,TLP基因分布在 8条染色体上,主要有4种结构类型,蛋白保守,氨基酸基序高度一致。在基因启动子区发现多个激素响应元件和胁迫响应元件。西瓜类甜蛋白归属10个聚类群。多数ClTLP基因在西瓜不同组织中表现为组成型表达,在根中的表达量高于茎和叶片。枯萎病菌侵染可以诱导大部分ClTLP基因的表达,且多数基因表达量在侵染后120 h最高。其中,Cla97C01G019790和Cla97C10G185250的表达随枯萎病菌侵染时间延长逐渐升高,而Cla97C10G204510和Cla97C10G185260的表达受到了枯萎病菌胁迫抑制。【结论】西瓜类甜蛋白家族有28个成员,其大多数CITLP基因的表达量在根中最高,可受枯萎病菌诱导,在西瓜抵御病原菌侵染过程中发挥重要作用。     

苹果‘国光’花柱中与S-RNase互作的钙调素结合蛋白研究

通过酵母双杂交的方法寻找苹果‘国光’花柱中与S-RNase互作的非S因子。以苹果‘国光’花柱为试材,构建了酵母cDNA文库,检测插入片段大小在300～2 000bp之间,符合库容要求。将S1-RNase成熟区cDNA序列S1-mat构建到pGBKT7载体上作为诱饵,筛选‘国光’花柱酵母cDNA文库。经文库筛选,获得一个大小为371bp的片段,与苹果全基因组序列比对后发现,该片段位于第9号染色体,其全长序列为552bp。NCBI BLAST比对及蛋白结构域分析显示其与拟南芥钙调素结合蛋白的同源性最高,且具有钙调素结合蛋白特有的磷酸二酯酶结构域。同时,酵母互作实验显示其与‘国光’花柱钙调素(CaM)有强烈互作,故认为此基因是苹果钙调素结合蛋白基因,命名为MdCaMBP。半定量RT-PCR结果显示其在‘国光’叶片及花的各组织中均有表达,与苹果花柱S1-、S2-、S9-RNase成熟多肽区均有互作且作用强烈。推测MdCaMBP可能作为一种S-RNase辅助因子参与了自交不亲和反应。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。     

叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库构建及其分析

 【目的】研究叶锈菌诱导小麦叶片的基因表达情况，从分子水平阐明小麦的抗病机制。【方法】以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料，利用抑制差减杂交技术，构建叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库，随机挑取文库中的阳性克隆测序，并对测序结果进行功能注释和分类。【结果】成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库，共获得3 456个阳性克隆。挑取165个阳性克隆进行测序，获得160条高质量EST。对EST序列进行聚类后，共获得107条非重复序列（Unigene），与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对，其中70条非重复序列与已知基因同源性很高，占全部非重复序列的65.4%。已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、转录调控及抗病防卫等多方面。【结论】通过对功能已知的基因分析，推测促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）、GTP结合蛋白（GTP-binding protein）、钙网蛋白（calreticulin）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase）、多聚泛素基因（polyubiquitin）、锌指蛋白（zinc-finger protein）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase）、转脂蛋白（lipid transfer protein）、类甜蛋白（thaumatin-like）、几丁质酶（chitinase）等可能参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。     

白色青年羊驼皮肤的基因表达分析

 【目的】研究羊驼皮肤功能发生的规律和机理以及发现新的功能基因。【方法】用SMART技术构建白色青年羊驼皮肤cDNA文库，随机挑取13 800个克隆进行规模测序。预处理后，获取高质量的表达序列。用CAP3对高质量序列进行拼接;BLAST对拼接序列进行同源比较，以注释功能;CLUSTER对已知序列进行聚类;根据标准基因词汇体系，并结合人组织基因表达谱分类标准，对具有注释信息的基因聚类进行分类，构建羊驼皮肤的基因表达谱。【结果】cDNA文库库容量达106PFU，从中获得高质量序列7 286条（在GenBank中命名为ASCD）。拼接成5 837条一致性序列，包括446条重叠群和5 391条单一序列。1 732条无相应注释，被认为是新基因。聚类成4 968个单基因簇（Unigene）。该基因表达谱最显著的特点是代表基本转录和翻译系统以及细胞骨架结构的转录本的表达丰度处于最高水平，原胶原I型（Procollagen typeI）等单个基因表达丰度处于较高水平。此外，还发现可能与羊驼毛质量、生长和毛色相关的基因。【结论】首次构建了羊驼皮肤cDNA文库和基因表达谱;获取的大量基因信息反映了青年期白色羊驼皮肤的生理特性和功能;该文库的构建是有效地发现新基因的理想资源。     

黄瓜和西瓜尖孢镰刀菌同工酶异质性分析

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对同一寄主尖孢镰刀菌进行了同工酶分析。结果表明,黄瓜不同部位分离的尖孢镰刀菌过氧化物酶同工酶酶谱是相同的,均为 3条过氧化物酶(POD)同工酶酶带,迁移率分别为 0.04、0.20和 0.33;而酯酶 (EST)同工酶酶谱存在较大的差异。西瓜尖孢镰刀菌都具有 4条POD同工酶酶带,电泳迁移率分别为 0.048、0.190、0.286和0.381,而EST同工酶条带很少,且存在较大差异。     

万寿菊杀菌素Ⅰ抑菌作用及对西瓜幼苗的影响

研究了万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌作用及对西瓜幼苗的影响。结果表明,万寿菊杀菌素Ⅰ能有效抑制西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌和辣椒疫霉病菌。在西瓜枯萎病的主要发病期苗期施用万寿菊杀菌素Ⅰ,能提高西瓜幼苗的POD和SOD活性,并维持CAT活性,有效减轻西瓜枯萎病菌对植株的毒害作用。     

防治西瓜枯萎病的微生物菌种的筛选与鉴定

[目的]对一组防治西瓜枯萎病的微生物菌种进行鉴定。[方法]以西瓜专化型尖孢镰刀菌为研究对象,从海洋海绵共生菌和土壤样品中筛选到6株具显著拮抗西瓜专化型尖孢镰刀菌的活性菌株,并对该6株活性菌株进行分子鉴定。[结果]分子鉴定显示该6株活性菌株均属于芽孢杆菌属的物种。[结论]试验结果为西瓜枯萎病类安全高效的生物农药及功能型生物肥料的创制提供了理论依据。     

不同熏蒸处理与生物有机肥联用对西瓜枯萎病的防控效果

使用生石灰+碳铵、棉隆、辣根素3种土壤熏蒸剂和"馕播王"生物有机肥联用对5 a连作西瓜土壤进行消毒处理,比较不同处理方式对连作西瓜枯萎病的防控效果,同时分析土壤pH值与尖孢镰刀菌西瓜专化型数量之间的相关性。结果表明:不同熏蒸处理对西瓜枯萎病的防控效果差异显著,其中棉隆处理定植45 d时,枯萎病发病率最低,为25.38%,相对防效为73.14%;随着处理时间的延长,各处理土壤中尖孢镰刀菌西瓜专化型的数量逐渐降低,也以棉隆处理的土壤病菌数量最少,定植45 d时与其他处理的病原菌数量差异达到10倍数量级;土壤熏蒸处理后,pH值均有所上升,但随着枯萎病的发生,pH值又有所下降。由此得出,3种熏蒸剂对西瓜枯萎病均有一定防效,但是棉隆与生物有机肥联用的效果最优,既能减少枯萎病致病菌的数量,还能提升土壤pH值。因此,该措施可作为我国南方地区设施西瓜早春栽培枯萎病的综合防控措施之一。     

西瓜和水稻根系分泌物中糖和氨基酸对西瓜枯萎病病原菌生长的影响

以不同抗性西瓜品种以及化感水稻品种为试验对象,对其根系分泌物中可溶性糖和游离氨基酸的含量和组成进行分析,并研究了氨基酸对西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)生长的影响。结果表明:西瓜根系分泌物中的可溶性糖含量及游离氨基酸的含量和种类显著多于水稻根系分泌物中的,而感病西瓜品种根系分泌物中的又显著多于抗病品种根系分泌物中的。与感病西瓜品种相比,抗病西瓜品种根系分泌物中不含酪氨酸,水稻根系分泌物中不含天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸这9种氨基酸。综合西瓜专化型尖孢镰刀菌孢子萌发和产孢能力两项测定结果,供试的8种外源氨基酸中丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸为主要促菌氨基酸;甲硫氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸均促进西瓜专化型尖孢镰刀菌孢子萌发却抑制其孢子产生,而丝氨酸为抑菌氨基酸。因此,水稻、西瓜根系分泌物在糖和氨基酸含量及组成方面存在的显著差异,可以使连作条件下西瓜单作和西瓜/旱作水稻间作对根际微生物的养分供应不同,对其生长的影响也随之改变,这为阐释连作条件下西瓜单作发病严重而间作发病减轻的机制提供了科学依据。     

西瓜与旱作水稻间作改善西瓜连作障碍及对土壤微生物区系的影响

 【目的】探讨西瓜与旱作水稻间作减缓西瓜连作障碍的可行性，并从微生物多样性与连作障碍关系角度阐释该方法的作用机理。【方法】盆栽方法研究西瓜与旱作水稻间作改善西瓜连作障碍的效果，传统微生物计数及磷脂脂肪酸（PLFA）法研究西瓜根际土壤微生物区系。【结果】西瓜连作土壤上单作西瓜其枯萎病发病率为 66.7%，死亡率为44.4%，与旱作水稻间作后西瓜生长正常。西瓜定植30 d后，间作处理西瓜根际的尖孢镰刀菌数量显著低于单作；50 d后，间作西瓜根际土中的真菌数量显著低于单作，而细菌、放线菌及总微生物数量均显著高于单作。磷脂脂肪酸（PLFA）法分析土壤微生物多样性发现，单作处理的西瓜根际土壤中真菌数量较多，细菌数量较少，而且主要是革兰氏阳性菌，而间作西瓜根际则含有较多的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和放线菌。间作处理西瓜体内的丙二醛（MDA）含量及保护性酶类如根系及叶片中的过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和根系中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均显著低于单作西瓜。【结论】西瓜与旱作水稻间作条件下西瓜根际尖孢镰刀菌数量显著降低，根际微生物区系向细菌与放线菌占主导的趋势发展，有效防止了西瓜枯萎病的发生，改善了西瓜连作障碍。     

小麦残茬对连作西瓜生长及根际土壤微生物的影响

【目的】土壤微生物群落结构构成是土壤生态环境质量的重要组成部分,探讨两种小麦残茬对连作西瓜生长及根际土壤微生物的影响,阐释西瓜枯萎病与根际土壤微生物间的关系,为西瓜连作障碍和枯萎病的生态防治提供依据。【方法】将D123和D125两种小麦残茬粉碎后施入瓜类连作土壤中并继续栽培西瓜,采用常规方法测定西瓜蔓长、鲜重及产量,稀释平板法测定根际土壤中细菌、真菌和尖孢镰刀菌数量,通过Real-time PCR测定西瓜根际土壤中功能微生物芽孢杆菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌数量。【结果】D123和D125两种小麦残茬的施入,促进了西瓜蔓长的伸长,并在后期显著促进了植株地上鲜重、根鲜重和全株鲜重的增加(P0.05),且D125处理略高于D123处理;残茬处理虽然增加了西瓜单株产量,但与对照(CK)差异不显著。对根际土壤微生物数量统计表明,定植第20天时,D125处理细菌数量显著高于D123处理与CK(P0.05),D123与CK间差异不显著;定植第30天时,D125处理细菌数量显著高于CK(P0.05),D123与CK、D125间差异均不显著。对真菌数量的研究表明,各时期均表现为D125D123CK,并在定植30 d时相互间差异显著(P0.05)。对根际尖孢镰刀菌数量的研究表明,各时期均表现为D125D123CK,在定植30 d时,D125处理显著高于D123处理和CK(P0.05),但D123处理和CK间差异不显著。土壤中细菌/真菌的比值随着取样时期的延长,呈下降趋势,细菌繁殖速度低于真菌繁殖速度;定植20 d时,D125处理的根际土壤中细菌/真菌的值显著高于D123处理和CK(P0.05),D123处理与CK间差异不显著。随着西瓜植株的生长,土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌的数量呈增长趋势,各时期尖孢镰刀菌均表现为CKD123D125,在定植第20天和第40天时表现为小麦残茬处理显著降低了尖孢镰刀菌数量(P0.05)。芽孢杆菌数据表明,各处理在定植30 d时芽孢杆菌数量均达到最高,其他时期均较低,小麦残茬的施入增加了根际土壤中芽孢杆菌数量,D125处理在各时期均表现为显著高于CK(P0.05),D123处理在定植后20 d和30 d表现为显著高于对照(P0.05),而D125处理在定植后20 d和40 d显著高于D123处理(P0.05),定植后30 d时则表现为相反的结果。【结论】小麦残茬的施入,促进了西瓜生长,有利于土壤微生物繁殖,并增加有益微生物数量,减少枯萎病致病菌数量,对西瓜连作土壤有一定的修复作用。     

西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)营养体亲和群研究

从浙江各地、江苏南部和上海等地采集的西瓜枯萎病株和其他瓜类植株上,分离纯化尖孢镰孢霉(Fusarium oxysporum)菌种23个(每个菌种来自一个植株样本).接种试验表明:酉瓜植株上分离的19个菌种,有16个对长蜜、新红宝和圳宝等3个酉瓜品种表现为致病性,而其他菌种表现为非致病性.所有23个菌种均获得抗氯酸盐的硝酸盐营养突变株(nit mutant).根据来自同一菌种nit突变株的营养体亲和性与突变类型鉴定,选择3个西瓜致病菌的Nit M类型突变株(W 024～5,W 072～4和W 014～9)为营养体亲和性测试株.各菌种上获得的nit突变株分别与测试株作营养体亲和性配对反应,23个菌种可划分成8个营养体亲和群(VCG)和1个营养体自身非亲和类型.16个西瓜致病菌中,除一个为营养体自身非亲和类型外,其余均属同一亲和群(M1001),而与西瓜非致病菌不存在营养体亲和反应.由此显示:营养体亲和群与西瓜枯萎病菌存在相关性,而与地理分布无关.     

西瓜枯萎病抗性及其嫁接对根际土壤微生物数量及群落结构的影响

 【目的】揭示不同枯萎病抗性西瓜品种根际土壤微生物的差异及嫁接提高抗病性的土壤微生物学基础。【方法】以抗枯萎病西瓜品种‘甜妞’和感枯萎病西瓜品种‘天使’为试材，以南瓜（博强1号）为嫁接砧木，采用平板计数及PCR-DGGE技术，研究抗感枯萎病西瓜品种自根苗、嫁接苗和砧木不同生育期根际土壤微生物数量及群落结构的变化。【结果】抗性品种根际土壤细菌数量在生育期的中后期显著高于感病品种，根际土壤真菌数量显著低于感病品种；感病品种嫁接后根际土壤细菌和放线菌数量均高于非嫁接处理，而镰孢菌除苗期外均低于非嫁接处理；PCR-DGGE结果表明，不同处理根际土壤细菌、真菌群落结构存在差异，且随生育期的变化而变化。对差异条带测序分析说明不同西瓜品种及嫁接砧木南瓜根际分布不同的细菌和真菌群。【结论】西瓜抗病品种的根际土壤细菌和放线菌的数量显著高于感病品种，而真菌和镰孢菌数量显著低于感病品种，品种的抗性与根际土壤微生物的种群和数量密切相关；嫁接提高了感病品种根际土壤细菌、放线菌微生物数量，抑制了枯萎病菌的积聚，改变了根际土壤微生物群落结构。植物基因型对根际土壤微生物群落结构有显著影响，而根际微生物群落结构的不同将导致植物对病原菌的抗性差异及品种差异。     

西瓜枯萎病生理小种1抗性QTL精细定位与InDel标记开发

【目的】通过QTL初定位检测栽培西瓜枯萎病生理小种1抗性的主效QTL,验证枯萎病抗性基因Fon-1的存在,结合亲本重测序信息开发紧密连锁易于检测的InDe1(insertion/deletion)分子标记,为西瓜枯萎病分子标记辅助育种提供技术支撑,并实现该QTL的精细定位,加速Fon-1的克隆和功能验证进程。【方法】以高抗枯萎病的栽培西瓜‘ZXG01478'和高感病的栽培西瓜‘14CB11'为亲本构建的F_2群体为试验材料,利用WinQTL cartographer 2.5软件基于复合区间作图法对枯萎病生理小种1抗性进行QTL定位。依据两个亲本材料进行高通量的重测序,并利用重测序信息,获取位于QTL置信区间的InDe1信息,利用自编的Per1程序提取参考基因组中插入缺失相应位置前后500 bp的序列,并利用Primer 5.0软件设计对应的InDe1引物对,开发InDe1标记。利用开发的InDe1标记进行精细定位(根据基因型鉴定结果找到群体中的交换单株,逐步缩小QTL区间)、图谱(利用JoinMap 4.0计算标记的连锁关系)和QTL的重新分析。并利用具有广泛代表性的130份不同抗性的西瓜种质资源的基因型和表型鉴定结果进行验证分析。【结果】F_2群体的病株率频率分布呈现明显的双峰分布且抗病和感病两种类型的株系分离比基本符合3:1的分离比(χ~2=0.52,P=0.47),表明西瓜枯萎病生理小种1抗性主要受一个主效QTL控制。F_2群体的QTL初定位在LG1鉴定到一个枯萎病抗性相关的主效QTL(fon1),其LOD峰值为26.05,解释80.18%的表型变异,置信区间对应的物理位置为1号染色体的193 333-2 775 577 bp。通过两个亲本重测序在QTL置信区间发现19个插入缺失片段大于20 bp的InDe1s,经引物设计与亲本筛选,获得理想引物12对,根据位于端点位置的插入缺失选取了6对InDe1引物利用F_2群体进行验证。初步的精细定位利用群体中的5个交换单株将QTL的置信区间锁定到InDe12_fon1的上游区域,连锁和QTL的重新分析结果显示新开发的一个分子标记InDe11_fon1出现在该QTL的峰值,LOD值为31.65,解释91.46%的表型变异。新开发的分子标记InDe11_fon1与已应用于枯萎病抗性研究的CAPS标记7716_fon在130份不同抗性的西瓜种质资源中的基因型鉴定结果完全一致,且基因型鉴定结果与田间抗病表型性状的符合率达70.8%。利用QTL峰值附近的SNP和InDe1标记与群体中的9个交换单株最终将fon1精细定位至246 kb的物理区间。【结论】主效QTL(fon1)验证了1号染色体上Fon-1的存在,并实现了精细定位。新开发的标记InDe11_fon1与Fon-1紧密连锁,且检测简单,成本低廉,能够更好的用于栽培西瓜枯萎病的分子标记辅助育种。