鲑鱼降钙基因向烟草遗传转化的初步研究

报道了鲑鱼降钙素基因植物表达载体的构建及其向烟草的遗传转化。由鲑鱼降钙素的链霉菌表达载体 p MS6 80 ,通过限制性内切酶 Bam H 和 H ind 双酶切后将其克隆至中间载体 p ART7,获得中间表达载体p ART7- s CT,从而给目的基因加上启动子和终止子 ,将限制性内切酶 N ot1酶切 p ART7- s CT得到的带有启动子和终止子的目的基因片段克隆至载体 p ART2 7,得到鲑鱼降钙素基因的植物表达载体 p ART2 7- s CT。通过农杆菌介导的叶盘法将其转至烟草 ,经 PCR检测已得到转基因植株。     

细胞质雄性不育相关基因orf224的克隆及其植物表达载体的构建

利用 PCR技术从油菜 Polim a不育系中扩增出细胞质雄性不育相关基因 orf 2 2 4 ,并将其克隆到p GEM- T Easy载体上得到重组质粒 p GEMORF。在此基础上 ,用限制性内切酶将 orf 2 2 4基因从质粒 p GEMORF上切下 ,连接在 p BI12 1质粒的 Ca MV 35 S启动子和 NOS终止子之间。经 PCR和酶切鉴定 ,得到了 orf 2 2 4基因的植物表达载体 p BIORF     

菜豆几丁质酶、烟草葡聚糖酶基因的分离克隆及双价表达载体的构建

几丁质酶基因(Chitinase,Chi)和葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase,Glu)具有协同抗真菌作用,根据GenBank号M13968,X53600分别设计引物,经RT-PCR扩增,克隆菜豆Chi基因和烟草Glu基因,将两个目的基因分别连上CaMV35S启动子和终止子Nos,然后串联在一起共同组建于一个表达载体pBI121中,重组表达质粒经过限制性酶切分析鉴定,结果表明含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功。为非洲菊、香石竹等花卉抗真菌基因工程育种奠定了基础。     

含绿色荧光蛋白及trp3iar基因的草菇表达载体的构建

分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶HindIII酶切,电泳后显示4 kb的trp3iar基因的目的片断和10 kb的载体片断,进一步测序证明重组质粒连接正确,成功构建了草菇的表达载体pSAGF。     

含绿色荧光蛋白及trp3iar基因的草菇表达载体的构建

分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶HindIII酶切,电泳后显示4 kb的trp3iar基因的目的片断和10 kb的载体片断,进一步测序证明重组质粒连接正确,成功构建了草菇的表达载体pSAGF。     

橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

【目的】克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(Hb HMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础。【方法】根据已报道的HEV2.1序列(Gen Bank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与Hb HMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定。【结果】用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852 bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%。将PHEV2.1与Hb HMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体p CAMBIA2301-PHEV2.1-Hb HMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功。【结论】将PHEV2.1和Hb HMGR1基因先构建到p CAMBIA3301载体上再克隆至p CAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至p CAMBIA2301载体上出现Pst I突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体p CAMBIA2301-PHEV2.1-Hb HMGR1。     

转SrPCS2烟草的获得及Cd抗性评价

由已克隆得到的长喙田菁(Sesbania rostrata)植物螯合肽合成酶SrPCS2编码177个氨基酸,以pHAN-NIBAL及pART27为基础,构建了CaMV35S启动子驱动的SrPCS2基因植物表达载体pAM23,采用电击转化方法将pAM23导入根癌农杆菌EHA105,并用该菌株对烟草进行了转化,Northern-blot分析结果表明得到了转录该基因的烟草,但转录该基因的烟草没有提高对Cd的抗性。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)的克隆及其植物表达载体的构建

用CTAB法提取豇豆叶片总DNA后,根据基因两端的保守序列设计引物,经PCR方法扩增得到CpTI基因,将其克隆到pMD-18T载体上,酶切并测序鉴定,将该基因登陆到GeneBank(NO.EU088405)并进行同源性鉴定,证明该基因为丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族中的一员。在此基础上,将CpTI基因用限制性内切酶BamHⅠ/SacⅠ切下后,克隆到pCUbi1303的UBI启动子和NOS终止子之间。经PCR和酶切鉴定,得到了该基因的真核表达载体pCUbiCpTI1303,为下一步的转基因做好了准备。     

NtSKP1基因的RNAi载体构建及对烟草的转化

根据枯斑三生烟草SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计二对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,分别扩增目的基因的正反向片段(约473 bp)。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL内含子右侧,正向目的片段插入该载体内含子左侧,再经NotⅠ酶切回收约3 916 bp目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段正反向重复序列的植物表达载体pART27-skp1sa。将pART27-skp1sa质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。     

菜豆几丁质酶、烟草葡聚糖酶基因的分离克隆及双价表达载体的构建*

 几丁质酶基因（Chitinase,Chi）和葡聚糖酶基因（β-1,3-glucanase,Glu）具有协同抗真菌作用，根据GenBank号M13968，X53600分别设计引物，经RT PCR扩增，克隆菜豆Chi基因和烟草Glu基因, 将两个目的基因分别连上CaMV 35S启动子和终止子Nos，然后串联在一起共同组建于一个表达载体pBI121中，重组表达质粒经过限制性酶切分析鉴定,结果表明含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功。为非洲菊、香石竹等花卉抗真菌基因工程育种奠定了基础。     

河源市近50年高温热浪变化特征分析

基于河源市5个国家气象观测站1971-2020年日最高气温数据,采用统计学、Mann-Kendall(M-K)突变检验、小波分析等方法分析了河源市各地高温的气候变化特征。结果表明:1971—2020年河源市高温热浪频次、和强度总体呈现增加趋势,各地呈东多西低趋势,高温日数平均增加趋势为0.46d/a,每年平均出现21.5d高温日和4.2次高温热浪事件,高温日和高温热浪事件主要出现在6—9月,高峰期在7-8月。龙川县高温天气出现频繁且持续时间较长,是河源市最热的地方,龙川县的高温日数年际变化存在较强波动性,在1971-1988年和1999-2007年期间有两个上升期,用M-K检验和滑动t检验方法,龙川县高温存在2个突变点。用小波分析方法分析得出河源市各地的高温热浪的周期性并不显著,只有和平县2006-2018年2-6年的周期,紫金县1994-2016年准2年、准5年周期和1982-2006年准12年的周期通过显著性检验。     

菏泽柿叶茶制作及品质评价

以“二糙”柿叶为材料,通过六种不同柿叶茶制作方法,在叶茶感官、总黄酮和维生素C含量进行了比较测定。结果表明,六种制作方法中,萎干两天,100℃水煮10s,自然晾干处理的叶茶总黄酮含量最高,数值为438.79 mg/g,其次是萎干两天,50℃烘干1小时,总黄酮含量为432.63mg/g。而维生素C含量是萎干1天,100℃水煮10s,自然晾干处理最高,数值为93.54mg/g；其次是萎干两天,50℃烘干1小时维生素C含量为88.40 mg/g；从叶茶感官比较,萎干两天,50℃烘干1小时和自然晾干所得叶茶色泽翠绿,其余处理叶色发黄。所以,萎干两天,50℃烘干1小时柿叶茶制作方法最好。