基因工程菌枯草芽孢杆菌GEB3产生的脂肽类抗生素及其生物活性研究

 利用MALDI TOF MS技术 ,鉴定了将lpaB3基因转入枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168菌株所构建的工程菌GEB3产生的脂肽类抗生素种类。结果表明 ,GEB3仅产生表面活性素 (surfactin) 1种脂肽类抗生素。经LC MS分析 ,GEB3产生由 13、14和 15个碳原子的脂肪酸链构成的标准表面活性素变异体 (standardsurfactinisoforms)。生物活性检测表明 ,该工程菌产生的脂肽类抗生素表面活性素具有抑制小麦纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长的作用     

枯草芽孢杆菌离子突变菌株H-74脂肽类抗菌物质对水稻抗性诱导作用

通过离子注入技术对枯草芽孢杆菌生防菌Bs-916突变选育,得到一株拮抗性能比出发菌Bs-916提高15 %以上的突变菌株H-74.通过对其抗菌物质的高效液相色谱(HPLC)分析表明,H-74分泌的脂肽类抗菌物质主要是表面活性素.在PDA平板上的水稻纹枯病菌菌丝抑制试验中,它能有效抑制新生菌丝的生长,并使细胞内含物外泄.盆栽控病试验表明,它对水稻纹枯病菌的相对防效达到73.35 %.将H-74分泌的脂肽类抗菌物质单喷于水稻植株上,测定与植物抗病相关的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化,发现其对植物抗病相关酶活性表达有明显的诱导作用.结果还显示同时接种脂肽类抗菌物质和水稻纹枯病菌处理对3个酶活性影响最大.     

解淀粉芽孢杆菌Lx-11产脂肽类物质鉴定及表面活性素对水稻细菌性条斑病的防治作用

【目的】对解淀粉芽孢杆菌Lx-11产生的脂肽类物质进行分离鉴定和水稻条斑病防效测定。【方法】根据脂肽类抗菌物质合成相关基因序列对Lx-11进行PCR扩增检测,采用MALDI-TOF-MS对脂肽类物质进行分析。【结果】通过3对特异性引物对Lx-11菌株检测,扩增产物经克隆、测序和BLAST分析,表明解淀粉芽孢杆菌Lx-11基因组中含有sfp、fenB、ituA或bamA基因。质谱分析发现提取的粗提物中含有surfactin、bacillomycin D和fengycin等3种脂肽类抗生素。通过构建surfactin突变体菌株,平板和盆栽试验显示突变体菌株抑制条斑病菌能力显著降低。【结论】解淀粉芽孢杆菌Lx-11产生的surfactin类物质对条斑病菌具有较强的抑制作用,是抑制条斑病菌主要物质之一。     

致病疫霉拮抗芽孢杆菌的筛选及脂肽类物质分离的研究

[目的]筛选致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)de Bary]拮抗芽孢杆菌并对其脂肽类物质进行分析。[方法]采用平板分离培养法从狗尾草[Setaria viridis(L.)Beauv]根际土壤中分离产芽孢细菌,采用对峙培养法对其进行初筛和复筛,并对其中杀菌效果较好的Y-3菌株的脂肽类物质进行了HPLC分析。[结果]初筛有9株细菌对P.infestans具有一定的拮抗作用,复筛得到Y-1和Y-3菌株对P.infestans的生长具有明显的抑制作用,抑菌率达80%以上;Y-3菌株产生的脂肽粗提物对P.infestans具有较好的拮抗作用,抑制率达90%以上,HPLC分析显示其脂肽粗提物主要包括8种组分。[结论]Y-3菌株产生的脂肽类物质抑菌效果显著,在生物防治马铃薯晚疫病方面具有潜在的应用价值。     

枯草芽孢杆菌E1R j产抗菌脂肽发酵条件的优化

通过对Bacillus subtilis E1R-j产脂肽物质的发酵条件的优化来提高脂肽物质产量,从而为工业化生产奠定基础。在Landy培养基中,采用单因素试验法确定对E1R-j菌株产脂肽物质的影响因素及水平,结合响应面法确定最佳发酵条件。结果表明,温度40℃、培养基初始pH 9.0、接种量3.0%、装液量50mL、转速200r/min为最佳发酵条件。在最佳发酵条件下培养,粗脂肽物质的质量浓度达1.39g/L,是原发酵条件下质量浓度0.55g/L的2倍多。优化后的培养条件提高了B.subtilis E1R-j产粗脂肽物质的量,表明响应面法是一种快速、有效、简单的优化方法。     

枯草芽孢杆菌产脂肽的发酵条件优化

[目的]优化枯草芽孢杆菌产脂肽的发酵条件,提高枯草芽孢杆菌ATCC21332脂肽产量。[方法]利用较低成本的底物对枯草芽孢杆菌ATCC21332进行发酵优化。[结果]枯草芽孢杆菌在葡萄糖浓度9 g/L、豆粕浓度40 g/L、接种量5%、装液量120 mL(500 mL容量瓶)、温度30°C、转速150 r/min、发酵时间120 h时,脂肽产量最高,为4 885.1 mg/L,比添加活性炭载体的最高产量3 600.0 mg/L增加了35.70%。通过测定发酵过程中不同时间段发酵液中氨基酸含量,发现在81 h时谷氨酸含量急剧增大,添加谷氨酸可使脂肽产量达954.0 mg/L,相比不添加谷氨酸的培养基可使脂肽产量增加近6倍。[结论]该研究为工业化生产提供新思路。     

甲基营养型芽孢杆菌BH21对葡萄灰霉病菌的拮抗作用

【目的】甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BH21是一株对葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有较好拮抗作用的海洋源细菌,鉴定该菌株脂肽类抗菌物质合成基因,检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌的拮抗作用,为应用该菌株防治葡萄灰霉病提供科学依据。【方法】通过特异引物的基因组PCR法检测甲基营养型芽孢杆菌BH21菌株合成脂肽的能力;盐酸沉淀和甲醇抽提法从无菌发酵液中提取脂肽粗提物;排油圈法检测脂肽粗提物的表面活性;采用菌丝生长速率法检测脂肽粗提物对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用并计算有效中浓度EC50;利用高效液相色谱技术(HPLC)对脂肽粗提物洗脱分离,并采用菌丝生长速率法检测各组分对葡萄灰霉病菌的抑制能力;采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析主要抑菌成分的脂肽类型。采用离体叶片接种法检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病的防治效果。【结果】选取11对特异引物对菌株BH21基因组扩增,其中7对引物扩增出预期核酸片段;扩增产物经测序、BLAST比对分析,结果显示扩增产物与相关菌株脂肽基因相似度为96%—99%,扩增产物翻译的蛋白与相关菌株的脂肽合成蛋白相似度为96%—100%,表明甲基营养型芽孢杆菌BH21基因组中含有ituA、bamD、ituC、ituD、fenD、srfAB、yndJ,该菌株具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的能力。盐酸沉淀和甲醇抽提从LB无菌发酵液中获得脂肽粗提物,得率为428 mg·L~(-1)。排油圈检测结果显示,脂肽粗提物使橄榄油膜形成排油圈,表明脂肽粗提物具有表面活性。脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌菌丝生长具有显著的抑制作用,脂肽粗提物浓度为440μg·mL~(-1)时,对葡萄灰霉病菌菌丝生长的相对抑制率为82.8%。根据毒力方程计算,抑制葡萄灰霉病菌菌丝生长的脂肽粗提物EC50为144.39μg·mL~(-1)。HPLC分离纯化脂肽粗提物获得6个组分,只有组分BH21-2和BH21-3抑制葡萄灰霉病菌的生长,RP-HPLC色谱图分析表明组分BH21-2和BH21-3属于fengycin家族脂肽。葡萄灰霉病离体叶片试验结果表明,脂肽粗提物浓度为400μg·mL~(-1)时,对葡萄叶片灰霉病防病效果为100%;脂肽粗提物浓度为220μg·mL~(-1)时,对葡萄叶片病斑扩展相对抑制率为94.4%。【结论】甲基营养型芽孢杆菌菌株BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的基因,该菌株脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌具有较强的拮抗作用,在葡萄灰霉病生物防治中具有应用潜力。     

Bacillus subtilis fmbR抗菌物质的分离和鉴定

 【目的】对Bacillus subtilis fmbR产生的抗菌物质进行分离和鉴定研究，以确定抗菌物质的组成和结构。【方法】采用HPLC和TLC层析对Bacillus subtilis fmbR抗菌物质进行分离纯化，通过ESI-MS和MALDI-MS分析对抗菌物质的组成和结构进行初步鉴定。【结果】HPLC层析表明了Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有保留时间与surfactin相似的成分。TLC层析和原位酸解证明了Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有闭合肽键类的物质，其中之一为相对迁移率Rf与标样surfactin相近的组分。采用ESI-MS分析检测到Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有分子量与surfactinA相同的m/z1009.1、m/z1023.2 和m/z1037.0等3种同系物；通过MALDI-MS分析获得[M+H]+为m/z 3403.95抗菌物质，该物质分子量与Bacillus subtilis 168产生的细菌素subtilosin的m/z3403.3 相同。【结论】Bacillus subtilis fmbR抗菌物质由C13～C15的3种surfactinA同系物和一种羊毛硫抗生素subtilosin组成。     

化学诱变枯草芽孢杆菌对大白菜根肿病的防治效果

[目的]研究化学诱变枯草芽孢杆菌对大白菜根肿病的防治效果.[方法]采用3株来自枯草芽孢杆菌XF-1的化学诱变菌株XF-1A、XF-1C和XF-1E进行大白菜根肿病的盆栽防病试验,并以MALDI-TOF-MS分析了3种抗生素的相对含量.[结果]菌株XF-1A和XF-1C防效较好,分别为68.80％和65.06％,XF-1E防效较差为42.21％.3菌株均能分泌表面活性素、伊枯草菌素和丰源素,但表面活性素和伊枯草菌素相对含量为XF-1A＞ XF-1C＞ XF-1E,XF-1A的表面活性素和伊枯草菌素分别达29.26％和35.31％,XF-1E的丰源素含量最高,达41.09％.[结论]表面活性素和伊枯草菌素含量与对根肿病防治效果存在一定的关联性     

芽胞杆菌产生的脂肽类化合物在防治油菜菌核病中的作用

从解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B3菌株和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)G4菌株中分别提取脂肽类化合物,配制成脂肽类生物农药乳油.平板拮抗活性检测试验表明,脂肽类生物农药乳油B3和G4能显著抑制油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)生长.油菜离体叶片接种试验中,脂肽类生物农药乳油B3和G4能显著抑制核盘菌在油菜叶片上的侵染和扩展.田间试验表明,脂肽类生物农药乳油B3和G4对油菜菌核病具有很好的防治效果,最高防效分别达55.8%和46.3%,并能够促进油菜生长