转基因水稻外源基因的遗传和表达初步研究

将天蚕抗菌肽B基因应用基因枪法导入水稻TN1发芽肿胚，获得转基因植株2株，转基因水稻T1－T5 5个世代不同株系，对bar基因、抗菌肽基因的遗传和表达进行初步研究。结果表明：转基因后代株系bar^R:bar^S在部分符合3：1分离比率。T1、T4转基因株系PCR、Southern印迹分析表明，T18株有抗菌肽B基因；T4仍有4个株系有抗菌肽基因，其他的株系基因丢失，T3 1个株系Northern印迹证明抗菌肽基因在RNA水平有表达；抗菌肽B转基因水委对白叶枯病的抗病性有提高，抗性能传递到高世代，在T3得到抗病性提高的株系。     

利用RNAi技术抗玉米矮花叶病效果研究

以采用RNAi技术获得的HiⅡ、HiⅡA、HiⅡB和H99抗玉米矮花叶病转基因T1和T2代为材料,通过病毒接种、草丁膦涂抹、目的基因和标记基因PCR扩增,研究了利用RNAi原理构建的目的基因对玉米矮花叶病的抗性效果以及玉米转基因后代群体鉴定筛选技术。结果表明,90.00%的转基因株系抗病性超过非转基因株系,30.00%的转基因株系抗病株率超过了抗病对照黄早4,转基因株系的抗病性明显提高,说明利用RNAi技术选育抗矮花叶病转基因玉米株系是可行的。4种筛选鉴定方法比较结果表明,目的基因PCR和病毒接种鉴定方法最可靠,在转基因后代群体鉴定过程中,可在苗期用200mg/L的草丁膦筛选阳性植株基础上,再采用目的基因PCR鉴定,筛选出抗性转基因植株或株系,不仅可以减少鉴定的工作量,而且可以提高鉴定的准确性。     

转hrpZpsta和chi双价广谱抗病基因大豆对疫霉根腐病的抗性分析

疫霉根腐病能使大豆感病品种减产5%～10%,并造成品质降低。利用转基因技术培育抗病品种是解决该问题的有效途径之一。对转hrpZ_(psta)和chi双价广谱抗病基因株系T2003-23-11、T2004-28-321和T2004-30-384进行分子检测并鉴定其抗疫霉根腐病能力。Southern Blot结果表明,hrpZ_(psta)和chi双价基因已整合在株系的核基因组中而且稳定遗传到T_4代;qRT-PCR结果表明,hrpZ_(psta)和chi双价基因在株系的不同组织中的相对表达量均高于非转基因对照。利用下胚轴侵染法对3个株系进行抗疫霉根腐病鉴定结果表明,3个株系抗病级别均为高抗,非转基因对照的抗病级别为中抗,表明转基因株系的抗病能力得到提高。     

乳糖诱导家蚕抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

根据家蚕抗菌肽Cecropin B的氨基酸序列,按大肠杆菌基因偏爱密码子,人工合成改造过的Cecropin B基因。将改造过的Cecropin B基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-41a中,构建了融合蛋白表达载体pET41a-cecB,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达Cecropin B的大肠杆菌工程菌株。通过SDS-PAGE分析,研究了用乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌BL21表达家蚕抗菌肽Cecropin B的诱导条件,得到乳糖的最佳用量为0.25 mmol/L、诱导起始浓度为OD 1.0、诱导时间为5 h。最终Cecropin B的表达量可占细胞总蛋白的17.1%。为乳糖作为诱导剂应用于大肠杆菌生产重组家蚕抗菌肽提供了参考依据。     

抗菌肽FAPs在毕赤酵母中的重组表达研究

将4种抗菌肽Fowlicidin-2、Cecropin B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和Thanatin串联,并在每种抗菌肽N-末端加上Kex2蛋白酶裂解位点,根据毕赤酵母密码子偏爱性,化学合成四种抗菌肽(Fusion Antimicrobial Peptides,FAPs)编码基因,连接到pPICZαC载体中,构建分泌型重组表达载体并转化毕赤酵母。经甲醇诱导后,Tricine-SDS-PAGE分析获得与目蛋白大小一致特异表达蛋白条带,每升发酵液上清含量达到32 mg。初步鉴定FAPs对大肠杆菌(E.coli)ATCC25922、金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌(S.syphimurium)C77-31和绿脓杆菌(P.aeruginosa)ATCC27853均有抑菌活性,且对S.aureus ATCC25923活性最强,最小抑菌浓度MIC为8.0μg·mL-1。     

马铃薯抗晚疫病转基因材料的获得及活性氧清除酶系与抗病过程关系分析

 【目的】获得马铃薯抗晚疫病转基因材料,初步分析活性氧清除酶系与抗病过程的关系。【方法】通过农杆菌介导的方法,以茎段为外植体,将抗晚疫病基因R1、R3a 和RB分别转化马铃薯感病栽培品种Desiree,并通过特异PCR扩增目的基因、无菌苗快速抗病鉴定和离体叶片接种鉴定、RT-PCR分析来筛选阳性转化株系。并测定转基因株系和野生型接种晚疫病原菌生理小种89148-9后,体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性变化。【结果】结果证明,3个抗晚疫病基因都已经整合进入马铃薯基因组中并稳定表达,所获得的转基因株系接种小种89148-9后其抗性有不同程度的提高,大部分表现为高抗或抗病,有明显的HR反应;转基因株系在接种小种89148-9后3种酶的活性都升高,且活性高峰比野生型早。【结论】获得了一批高抗或抗晚疫病的马铃薯转基因材料;活性氧清除酶系可能参与了R基因介导的抗病过程。     

利用分子标记辅助选择培育转 Bt基因抗虫水稻

为培育转Bt基因抗虫水稻品种材料,以传统杂交的方法将3个Bt明恢63中的Bt基因cry1C*、cry2A*和cry1Ac/Ab,转育到水稻品种秀水123、湘晴、旱恢3号和沪旱1B中;以回交二代自交三代（BC2F3）水稻叶片为材料,利用分子标记辅助选择、田间除草剂筛选和试纸条检测方法,以获得新型转Bt基因株系。并在全生育期实行除不喷施农药外的正常田间管理的转基因植株的田间抗虫鉴定方法筛选出抗虫性良好、农艺性状优良的株系,为后续抗虫育种提供材料。 BC2 F3代PCR检测及试纸条检测的结果显示分别获得cry1C*和cry2A*基因的沪旱1B、秀水123和湘晴的纯合株系。同时,在田间自然诱发虫害条件下,转基因株系对稻纵卷叶螟虫表现出强抗性。     

抗菌肽Cecropin B基因的克隆及体内活性检测方法的构建

根据家蚕抗菌肽基因的序列设计引物，从家蚕蛹脂肪体中扩增家蚕Cecropin B基因，并利用CST融合表达系统进行表达。融合蛋白的表达量受表达诱导剂IPTG浓度控制，利用融合蛋白对宿主菌的部分抑菌作用，建立灵敏、简便的家蚕Cecropin B体内抗菌活性检测方法。     

转基因甘蔗抗黑穗病鉴定研究

用分离得到的甘蔗黑穗病病菌单孢子菌丝体对5个甘蔗转基因株系进行体外抑菌作用鉴定,结果显示,5个转基因株系对甘蔗黑穗病均有不同程度的抗性表现;通过人工接种方法对转基因植株（T1）进行了甘蔗黑穗病病菌的田间接种实验,利用病害流行指标LP、SDD、IPmax、Ymax、AUDPC对其后代（他）进行抗病性鉴定,结果表明,SCG1和SCG2两个株系表现为抗病（R）,而SCG3、SCG4和SCG5三个株系表现为中抗（Ⅰ）;并结合RT-PCR技术鉴定目的基因在转基因甘蔗无性系后代（T2）中的表达,结果显示两个目的基因在转基因甘蔗无性系12中均有表达,此结果与其抗病表现一致。     

转反义PLDγ基因小麦的获得及其抗白粉病的初步鉴定

利用穗茎注射法将反义PLDγ基因导入烟农15和农大1521两个小麦品种中,旨在获得抗病性增强的转基因植株。结果表明:T3代经PCR及PCR-Southern杂交鉴定,目的基因已经整合到小麦的基因组中,并能在小麦基因组内稳定遗传;烟农15和农大1521的6个转基因株系的抗白粉病的能力明显增强。