GST pull-down联合LC-MS/MS筛选柑橘抗溃疡病转录因子CsBZIP40的互作蛋白

【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白（Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973）可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。     

柑橘Rboh家族鉴定及其对激素和柑橘溃疡病的响应

【目的】活性氧(reactive oxygen species,ROS)是植物抗病反应中重要的信号分子,而Rboh是参与活性氧产生的关键酶之一。本研究通过鉴定和分析柑橘全基因组中Rboh基因家族生物信息学特性、生物胁迫相关植物激素和溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染诱导下表达模式,为研究Rboh基因家族与柑橘抗溃疡病过程的相关性,进一步研究和利用柑橘Rboh基因打下基础。【方法】利用过氧化物酶数据库RedOxiBase和柑橘(甜橙)CAP数据库获得柑橘Rboh家族序列信息;利用生物信息学软件对CsRboh进行理化性质、系统进化关系、染色体定位、基因结构、蛋白功能结构域、保守基序和启动子元件系统分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析植物激素水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)和溃疡病菌处理下CsRboh表达模式。【结果】鉴定得到7个柑橘Rboh家族成员(CsRboh01—CsRboh07),其编码蛋白包含784—946个不等的氨基酸残基,等电点(PI)分布在8.67—9.40,主要定位于细胞膜结构和细胞质。根据系统进化树可将柑橘Rboh家族划分为I—IV 4个亚家族。CsRboh家族基因不均匀分布在甜橙的5条染色体,均含有典型的呼吸爆发NADPH氧化酶结构域(NADPH_Ox)、铁还原酶跨膜组件(Ferric_reduct)、FAD结合结构域(FAD_binding)和铁还原酶NAD结合结构域(NAD_binding)4个功能结构域。CsRboh家族各基因的启动子区域含不同激素响应元件,数目和类型各有差异。qRT-PCR结果显示CsRboh基因家族各成员可响应激素和溃疡病菌诱导,在不同激素和溃疡病菌处理下感病品种晚锦橙和抗病品种四季橘中表达模式具有差异。结合系统进化树聚类分析、同源基因功能研究及其启动子区域顺式作用元件分析发现,CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06在抗、感两个品种中受柑橘溃疡病菌诱导表现出明显不同的表达趋势和表达量。【结论】CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06可能与柑橘品种抗、感性密切相关,是3个有潜力的抗溃疡病分子育种候选基因,初步确定CsRboh家族基因在柑橘响应溃疡病过程中发挥关键作用。     

柑橘Rboh家族鉴定及其对激素和柑橘溃疡病的响应

【目的】活性氧（reactive oxygen species,ROS）是植物抗病反应中重要的信号分子,而Rboh是参与活性氧产生的关键酶之一。本研究通过鉴定和分析柑橘全基因组中Rboh基因家族生物信息学特性、生物胁迫相关植物激素和溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染诱导下表达模式,为研究Rboh基因家族与柑橘抗溃疡病过程的相关性,进一步研究和利用柑橘Rboh基因打下基础。【方法】利用过氧化物酶数据库RedOxiBase和柑橘（甜橙）CAP数据库获得柑橘Rboh家族序列信息;利用生物信息学软件对CsRboh进行理化性质、系统进化关系、染色体定位、基因结构、蛋白功能结构域、保守基序和启动子元件系统分析。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析植物激素水杨酸（salicylic acid,SA）、茉莉酸（jasmonic acid,JA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）和溃疡病菌处理下CsRboh表达模式。【结果】鉴定得到7个柑橘Rboh家族成员（CsRboh01—CsRboh07）,其编码蛋白包含784—946个不等的氨基酸残基,等电点（PI）分布在8.67—9.40,主要定位于细胞膜结构和细胞质。根据系统进化树可将柑橘Rboh家族划分为I—IV 4个亚家族。CsRboh家族基因不均匀分布在甜橙的5条染色体,均含有典型的呼吸爆发NADPH氧化酶结构域（NADPH_Ox）、铁还原酶跨膜组件（Ferric_reduct）、FAD结合结构域（FAD_binding）和铁还原酶NAD结合结构域（NAD_binding）4个功能结构域。CsRboh家族各基因的启动子区域含不同激素响应元件,数目和类型各有差异。qRT-PCR结果显示CsRboh基因家族各成员可响应激素和溃疡病菌诱导,在不同激素和溃疡病菌处理下感病品种晚锦橙和抗病品种四季橘中表达模式具有差异。结合系统进化树聚类分析、同源基因功能研究及其启动子区域顺式作用元件分析发现,CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06在抗、感两个品种中受柑橘溃疡病菌诱导表现出明显不同的表达趋势和表达量。【结论】CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06可能与柑橘品种抗、感性密切相关,是3个有潜力的抗溃疡病分子育种候选基因,初步确定CsRboh家族基因在柑橘响应溃疡病过程中发挥关键作用。     

基于转录组信息的黑果枸杞MYB转录因子家族分析

【目的】MYB基因家族是植物中最大的一类转录因子家族,广泛参与植物的生长发育和代谢调控过程。目前仍没有针对枸杞等木本作物MYB转录因子家族的系统分析。基于转录组数据鉴定分析黑果枸杞MYB基因家族,可为该类基因生物学功能和代谢调控机制的研究提供参考。【方法】基于黑果枸杞转录组测序(RNA-Seq)数据,利用NR、NT、Swiss-Prot和PFAM 4个数据库和NCBI网站,对黑果枸杞MYB基因进行筛选注释;利用Web Logo3、Prot Comp 9.0、MEGA5.0软件进行保守结构域、亚细胞定位和系统进化等生物信息学分析。基于转录组数据分析MYB基因在黑果枸杞果实不同发育期的差异表达模式,并采用荧光定量PCR方法进行验证。【结果】基于转录组测序数据,注释得到83个黑果枸杞MYB类转录因子基因,根据结构特性将其分为4大类:R2R3-MYB、1R-MYB、3R-MYB和4R-MYB。结构域分析表明:R2R3-MYB类转录因子的R2 MYB基序中包含3个极度保守的色氨酸残基,R3 MYB基序中的第一个色氨酸残基被疏水氨基酸替代。比较分析黑果枸杞MYB家族和拟南芥MYB家族共同构建的进化树发现,黑果枸杞的MYB家族在进化上包括3个大类,6个亚类。亚细胞定位预测结果显示,44个MYB转录因子定位于细胞质中,37个定位于细胞核中。基于转录组数据的MYB差异表达模式分析表明,黑果枸杞MYB基因可能参与了果实不同发育时期花青素变化的调控;基于荧光定量PCR的差异表达数据进一步验证了部分MYB转录因子在果实不同发育时期的花青素合成中可能起到调控作用。【结论】黑果枸杞MYB基因家族注释得到83个黑果枸杞MYB类转录因子基因,为进一步研究MYB家族的基因结构和生物学功能奠定了基础。     

柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域（LRR_1和LRR_2）;构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP（GSVIVT01033370001）遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个（OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14）为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系（8个株系）进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降（为野生型的23.12%—75.49%）,其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。     

芥菜TCP转录因子家族全基因组鉴定及表达分析

【目的】对芥菜基因组中TCP转录因子家族基因成员进行鉴定和序列分析,并分析TCP家族基因在茎发育时期的表达水平,为研究芥菜TCP基因功能和茎膨大机理提供基因源和理论依据。【方法】从芸薹属基因组数据库下载芥菜基因组数据,结合转录组数据,对芥菜TCP转录因子家族成员进行鉴定,并利用生物信息学方法对该家族成员进行理化性质、亚细胞定位、系统发育关系、基因结构、染色体定位及茎不同发育时期基因表达谱等方面的分析。【结果】芥菜TCP家族共有53个成员;系统进化树分析可分为两个大的亚组;TCP基因大都位于细胞核上,但理化性质差异很大;大部分基因没有内含子,基因结构保守性较高;在染色体上分布不均;表达模式分析显示TCP家族基因可能在芥菜茎膨大中起重要作用。【结论】鉴定了53个芥菜TCP家族基因成员,并发现PCF亚组成员在芥菜茎发育时期特异性表达,可能在芥菜茎的生长发育过程中起重要作用,该研究为芥菜及其他植物中TCP家族的鉴定和功能研究提供了理论基础。     

受病原细菌诱导表达增强的水稻转录因子基因OsBTF3的分子鉴定

 【目的】分子克隆和定性分析受水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)诱导的水稻转录因子基因OsBTF3。【方法】用生物信息学和RT-PCR方法鉴定和分离OsBTF3基因全长cDNA序列;用原核表达和亚细胞定位方法分析产物表达及其定位;用RT-Q-PCR方法分析基因的组织表达特性和对Xoo侵染的的应答表达。【结果】从水稻品种日本晴cDNA中克隆了OsBTF3全长序列,它编码具有175个氨基酸的蛋白质,具有核定位信号和NAC保守结构域;OsBTF3与其它植物BTF3序列同源性可达79%～88%;在大肠杆菌中表达产生一个与预测分子量大小一致的27 kD蛋白质;OsBTF3::GFP融合蛋白主要在细胞核和细胞膜出现;OsBTF3基因在水稻不同发育期和组织中均有表达,但显著地受Xoo侵染的诱导而增强。【结论】成功分离了一个受Xoo诱导表达增强的水稻转录因子基因OsBTF3;OsBTF3主要定位于细胞核和细胞膜,可能在水稻感病性表达中起调控作用。     

大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱（DGEP）数据分析,获得一个MYB转录因子GmMYB111;以盐胁迫处理的cDNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因cDNA编码序列;根据GmMYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与GmMYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用 MEGA5.05对GmMYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析GmMYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱（DGEP）数据获得盐胁迫响应显著上调（27倍）的GmMYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与GmMYB76、GmMYB12a以及苜蓿MtMYB61的亲缘关系最近; GmMYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,GmMYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,GmMYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,GmMYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示GmMYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,GmMYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】GmMYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。     

三株柑橘溃疡病生防内生细菌对脐橙感染溃疡病后几种防御酶活性的影响

防御酶活性是寄主防卫反应能力的重要指标,很多生防因子可引起植物的防御酶活性增强。在前期工作中筛选到3株对柑橘溃疡病有防治效果的内生细菌Bacillus sp.、GN222、Kosakonia cowanii GN223和Bacillus subtilis GN232,为明确其防病机理,测定了3株细菌对纽荷尔脐橙感染溃疡病菌后几种防御酶活性的影响。结果表明,在感染溃疡病菌的情况下,3株内生细菌均可不同程度地诱导和增强脐橙树体内防御酶的活性。其中内生细菌对树体多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)的诱导强度小于溃疡病菌对这2种酶的诱导;菌株GN222对树体过氧化氢酶(CAT)的增强作用明显强于其他菌株;菌株GN223对树体过氧化物酶(POD)的诱导作用强于其他菌株;各处理中SOD活性总体较弱。总之,待测内生细菌对脐橙感染溃疡病菌过程中防御酶具有一定的诱导作用,但酶活性变化的时间和幅度因内生菌株不同而有明显的差异。试验结果可为3株内生细菌应用于柑橘溃疡病的生物防治提供理论依据。     

玉米大斑病菌环腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表达分析

【目的】获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)环腺苷酸磷酸二酯酶(c AMP phosphodiesterase,PDE)基因,并分析其在病菌侵染结构发育过程及侵染寄主早期阶段中的表达,为深入探索c AMP信号途径调控病菌致病性的作用机制打下基础。【方法】根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和黑曲霉(Aspergillus niger)6种真菌PDE基因的保守序列,利用简并引物PCR对基因保守片段进行扩增,结合RACE和Genome Walking技术获得基因全长及其侧翼序列;利用MEGA 5.0软件对PDE蛋白预测编码产物进行多重序列比对,并采用邻近法构建系统发育树;利用GSDS分析基因结构,Prot Param分析理化性质,SOMPA预测二级结构,SMART数据库在线分析保守结构域;收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主叶片不同时间的玉米大斑病菌材料,利用q RT-PCR技术研究StPDE在病菌侵染结构形成过程中不同阶段的转录水平。【结果】玉米大斑病菌基因组中存在1个高亲和力磷酸二酯酶基因(StH-PDE)和1个低亲和力磷酸二酯酶基因(StL-PDE)。其中,StH-PDE全长3 208 bp,包含5个内含子和6个外显子,ORF为2 898 bp。StL-PDE全长5054 bp,包含4个内含子和5个外显子,ORF为3 090 bp。StH-PDE和StL-PDE分别含有保守的Ⅰ型和Ⅱ型c AMP磷酸二酯酶催化结构域。不同的植物病原真菌中PDE同源基因分别呈现出高度的相似性,其中,StH-PDE与Magnaporthe grisea、Cordyceps militaris、Metarhizium acridum等病原真菌的高亲和力磷酸二酯酶基因聚于同一进化支,StL-PDE与Ascochyta rabiri、Scedosporium apiospermum、Fusarium oxysporum、Metarhizium album等病原真菌的低亲和力磷酸二酯酶基因聚于相同进化支。人造疏水介质诱导下,与菌丝相比,StH-PDE和StL-PDE在分生孢子中的表达水平均显著上调,其中StH-PDE和StL-PDE分别上调了约2倍和52倍。孢子萌发初期两个基因表达水平显著下调,随着萌发的进行,表达水平缓慢回升,至附着胞形成阶段,基因表达出现了第2次高峰,随后表达水平再次下调。在整个过程中,StH-PDE的最高表达水平则出现在附着胞形成时期,达到了菌丝体中的近7倍、分生孢子中的近2倍,而StL-PDE的表达水平始终低于其在分生孢子中的表达水平。StH-PDE和StL-PDE在病菌侵染寄主过程中的表达水平变化趋势与其在人工疏水介质诱导下的表现基本一致。在孢子萌发早期表达显著下调,随着时间延长,缓慢回升,至接种后18和24 h StH-PDE表达水平上调,超过萌发初期。【结论】在病菌侵染结构发育过程中,StH-PDE和StL-PDE均呈现下调-上调-下调的表达水平变化趋势。StH-PDE在附着胞时期表达水平最高,StL-PDE在分生孢子中的相对表达水平最高。     

超量表达CsGH3.6通过抑制生长素信号转导 增强柑橘溃疡病抗性

背景 由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）引起的柑橘溃疡病是柑橘生产上最具毁灭性的一种病害。植物生长素在调控柑橘溃疡病菌引起的寄主侵染部位脓疱形成中起重要作用。生长素早期响应基因GH3通过酰基化吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）调控植物激素动态平衡。前期研究发现柑橘CsGH3.6在调控生长素响应溃疡病侵染中起着重要作用。目的 通过对超量表达CsGH3.6转基因晚锦橙的抗病性、植株表型、细胞和激素变化进行分析,利用RNA-Seq解析CsGH3.6调控的信号通路,探明CsGH3.6调控激素动态平衡影响柑橘溃疡病抗性的内在机制。方法 利用针刺法对离体转基因叶片接种溃疡病菌Xcc,统计接种第10 天时病斑面积和病情指数,以野生型为对照,评价转基因植株的抗性水平;提取感病前后叶片内源激素,利用高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography,HPLC )检测转基因植株中激素含量变化;温室中观察转基因植株表型变化;通过测量叶片纵径、横径和厚度分析转基因植株叶型变化特征;制备叶片表皮切片,显微观察表皮细胞和气孔,并统计转基因植株表皮细胞长度和气孔密度;采用RNA-Seq测序技术研究转基因植株转录组变化情况,并利用Nr、Nt、Pfam、COG、SwissProt和gene ontology (GO)数据库注释基因功能,进一步利用KEEG数据库和MapMan软件解析超量表达CsGH3.6影响的重要基因、功能和途径,阐明CsGH3.6调控柑橘溃疡病抗性的分子机制。结果 超量表达CsGH3.6显著增强转基因植株的溃疡病抗性;转基因植株分枝增多且下垂,叶片向上卷曲,变小,颜色浅;转基因植株气孔密度增加,表皮细胞变短;激素含量分析显示,转基因植株自由生长素（IAA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）含量显著降低,而水杨酸（salicylic acid,SA）含量显著增加;转录组测序分析表明,超量表达CsGH3.6显著抑制生长素信号转导相关基因表达,特别是所有注释的Aux/IAA家族基因均下调表达,相反,与生物胁迫相关基因的表达为上调,其中绝大部分基因为病程相关蛋白基因。结论 超量表达CsGH3.6通过酰基化自由IAA抑制生长素信号转导,调控JA和SA的动态平衡,改变细胞和植株的形态建成,从而增强柑橘对溃疡病的抗性。研究结果暗示调控激素动态平衡在柑橘抗病育种中具有潜在价值。     

温度和多胺对柑橘溃疡病发生的影响及作用机制

【目的】溃疡病是严重危害柑橘的一种细菌性病害,通常在高温下容易发生。论文旨在阐明高温下柑橘易发生溃疡病的机制,揭示其代谢变化,为利用药剂防治溃疡病提供重要的理论指导。【方法】以感病的甜橙(Citrus sinensis)为研究对象,在21℃和30℃下预培养3 d,然后均接种同样浓度(108 cfu/m L)的柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)10μL,比较两组植株的发病率,采用半定量RT-PCR分析两种温度下4个抗病基因AOS、CHI、GPX和PR4A的表达量,利用HPLC测定预培养3 d后叶片内源多胺(腐胺、亚精胺和精胺)的含量。在此基础上,利用外源亚精胺(0.4 mmol·L-1)处理甜橙植株(以清水处理为对照),比较亚精胺和清水处理的植株接种溃疡病菌后的发病率和病情指数,分析亚精胺处理对内源多胺含量和抗病基因AOS、CHI、GPX和PR4A表达的影响。【结果】溃疡病菌接种后观察发现,21℃培养植株溃疡病的发病率在前期低于30℃培养的植株,至第10天时,两个处理组植株的发病率接近;同时HPLC测定发现,21℃培养植株叶片3种自由态多胺(腐胺、亚精胺和精胺)含量高于30℃培养植株;RT-PCR分析表明,CHI、GPX和PR4A这3个抗病基因的表达量在21℃培养植株中高于30℃培养植株,而AOS表达水平在两组材料中差异不明显。外源亚精胺处理显著增加了内源腐胺和亚精胺的含量,降低了所处理植株接种溃疡病菌后的发病率和病情指数,接种后14 d发病率比对照降低45%,病情指数比对照降低4.8,而由表型可见对照发病程度重于亚精胺处理材料。此外,亚精胺处理能够增强AOS、CHI、GPX和PR4A 4个抗病基因的表达量。【结论】高温下甜橙更易发生溃疡病的可能机制是高温抑制抗病基因的表达和多胺合成。外源多胺处理能够降低甜橙发生溃疡病,可能机制是多胺处理后增强了抗病基因的表达,诱发植株的抗病反应最终表现出抗病。因此,高温是影响溃疡病发生的一个关键环境因子,多胺有助于提高对柑橘溃疡病的抗性。     

生防菌枯草芽孢杆菌CQBS03的绿色荧光蛋白基因标记及其在柑橘叶片上的定殖

【目的】利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因标记枯草芽孢杆菌生防菌株CQBS03,以研究其在柑橘叶片上的定殖规律。【方法】采用重叠PCR方法将p43启动子和gfp进行融合,并与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK连接构建重组质粒pHY43G,以重组质粒电脉冲转化生防菌株CQBS03,培养后于荧光显微镜下观察并通过SDS-PAGE分析工程菌株GFP的表达情况,然后进行工程菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用叶片喷雾方法接种,平皿稀释分离培养方法测定CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的定殖情况。【结果】重组菌CQBS03-pHY43G高效表达GFP,电泳后出现约29kDa的特异蛋白条带,外源质粒对宿主菌的生长未带来明显不利影响,质粒稳定性实验表明重组质粒pHY43G经30次传代后的稳定性为55%,室内平板抑菌实验结果显示CQBS03-pHY43G对柑橘溃疡病菌生防效果与出发菌株没有明显差异(P0.01),CQBS03-pHY43G菌株在叶片喷雾接种后的0—15d,在柑橘叶片上的数量呈现急剧下降趋势,15d后下降速度稍缓,最后保持相对稳定的较低水平(1.73×103cfu·g-1)。【结论】成功地将gfp转入野生型枯草芽孢杆菌生防菌CQBS03中,构建了荧光标记菌株,初步明确了生防菌的定殖规律。     

Production of Transgenic Anliucheng Sweet Orange (Citrus sinensis Osbeck) with Xa21 Gene for Potential Canker Resistance

Citrus canker, an epidemic quarantine disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri, has brought a great damage in citrus production worldwide. Herein, a rice PRR (pattern recognition receptor) gene Xa21 together with GUS reporter gene and hygromycin phosphotransferase gene (HPT) was introduced into Anliucheng sweet orange (Citrus sinensis Osbeck) via Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic callus. The transgenic calluses were screened on MT basal medium containing hygromycin (HYG) and detected by histochemical GUS staining. The transgenic plantlets were recovered through somatic embryogenesis pathway. The regenerated plantlets were accustomed to and maintained in the greenhouse. The transgene integration of recovered plantlets was identified by PCR and Southern blot hybridization. It showed that all the transgenic plantlets tested had undergone single copy integration, the expression of Xa21 in eight different transgenic lines detected by qRT-PCR can be divided into three grades, high for T5 and T6, middle for T4 and low for the rest. The tolerance to citrus canker disease of the three recovered transgenic lines T2, T4 and T6 was assessed by in vitro pin-puncture inoculation. The results showed that all the three transgenic lines conferred improved resistance to citrus canker bacterium infection and the T4 transgenic line displayed the highest resistance. The mechanism and feasibility of rice Xa21 in triggering innate immunity in citrus was briefly discussed.     

南宁市柑橘木虱自然天敌种类调查

【目的】明确南宁市柑橘木虱（Diaphorina citri）自然天敌种类以及柑橘木虱数量与天敌数量的相关性,为利用天敌防控柑橘木虱提供科学依据。【方法】 2020年8月—2021年7月在广西大学农场多功能标本园内未喷施过化学农药的九里香绿篱和广西创新驱动专项基地内砂糖橘果树上采用随机取样法调查柑橘木虱自然天敌种类,统计捕食性天敌的数量及寄生性天敌的寄生率,每15 d调查1次。【结果】调查发现南宁市柑橘木虱的自然天敌共有15种,其中昆虫纲天敌9种,包括六斑月瓢虫（Menochilus sexmaculata）、龟纹瓢虫（Propylea japonica）、双带盘瓢虫（Lemnia biplagiata）、粗网巧瓢虫（Oenopia chinensis）、异色瓢虫（Harmonia axyridis）、中华草蛉（Chrysoperla sinica）、亮腹釉小蜂（Tamarixia radiate）、阿里食虱跳小蜂（Diaphorencyrtus aligarhensis）及豹纹花翅蚜小蜂（Marietta picta）;蛛形纲天敌6种,条纹金蝉蛛（Phintella vittata）、角红蟹蛛（Thomisus labefactus）、锈宽胸蝇虎（Rhene rubigera）、多色金蝉蛛（P.versicolor）、斜纹猫蛛（Oxyopes sertatus）及园果大赤螨（Anystis baccarum）。发现亮腹釉小蜂的1种寄生蜂黄食虱跳小蜂（Psyllaphycus diaphorinae）。【结论】南宁市柑橘木虱自然天敌共15种,主要捕食性天敌为六斑月瓢虫,主要寄生性天敌为亮腹釉小蜂。当地柑橘木虱自然天敌资源丰富,在田间应加强保护和合理利用,提高天敌对柑橘木虱的自然控制能力。     

转CiNPR4基因柑橘抗溃疡病的机制解析

【目的】病程相关基因非表达子1（non-expressor of pathogenesis-related gene 1,NPR1）是水杨酸（salicylic acid,SA）介导的系统获得性抗性信号转导途径中一个重要的转录因子,在调节植物的抗病方面发挥着关键性的作用。研究耐黄龙病的‘Jackson’葡萄柚（Citrus paradisi）中的NPR1-like基因CiNPR4对柑橘溃疡病的抗性,解析过表达CiNPR4的转基因晚锦橙（C. sinensis）抗柑橘溃疡病的机理。【方法】选取黄龙病抗性增强的CiNPR4转基因柑橘,采取完全成熟的叶片利用针刺法进行柑橘溃疡病的离体抗性评价分析;在此基础上,对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株利用针刺法离体接种溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）,统计接种Xcc后0、1、3、5、7和9 d的细菌数量;利用注射法对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片接种Xcc,接种后0、3和5 d收集接种部位的叶片,测定叶片中SA和茉莉酸（jasmonic acid,JA）含量;同时,收集接种Xcc后0、3和5 d接种部位的叶片,利用实时荧光定量 PCR分析SA和JA分别介导的防御反应相关基因CsPR1和CsPDF1.2在Xcc诱导下表达水平的变化;根据CiNPR4蛋白与TGA转录因子相互作用网络预测CiNPR4互作蛋白为Ciclev10005080m和Ciclev10001081m,以甜橙为参考基因组,将这两个基因在https://www.citrusgenomedb.org/网站上进行blastx分析,预测CiNPR4在甜橙基因组中互作的候选蛋白,克隆CiNPR4和候选蛋白基因的cDNA,利用同源重组法分别构建诱饵载体和猎物载体,并将诱饵质粒和猎物质粒共转入酵母菌株Y2HGold中,进行点对点酵母双杂交分析。【结果】CiNPR4的超量表达减轻了转基因柑橘叶片上溃疡病的症状,柑橘溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片上Xcc的生长比较缓慢,在接种Xcc后9 d,转基因植株Xcc数量显著低于野生型（wild type,WT）晚锦橙;Xcc诱导0 d,溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株含有与WT植株无差异的SA含量,随着Xcc诱导时间的延长,CiNPR4转基因植株中SA的含量显著增加;而Xcc处理0 d时,WT植株含有显著高于CiNPR4转基因植株的JA含量,随后,JA含量在CiNPR4转基因植株中逐步上升,Xcc处理5 d时,达到显著高于WT植株的水平;而WT植株在整个处理期间SA和JA的含量基本保持不变;溃疡病抗性增强的转基因植株受Xcc诱导3 d时CsPR1的表达水平迅速上升,达到与WT植株差异显著的水平,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升;WT植株受Xcc诱导后CsPR1的表达水平没有发生显著变化,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升,且显著高于CiNPR4转基因植株中CsPDF1.2的表达水平;酵母双杂交分析证实,CiNPR4与甜橙基因组中的CsTGA2转录因子互作。【结论】CiNPR4与CsTGA2转录因子互作,通过促进SA而抑制JA介导的防御反应,调控转基因柑橘对溃疡病的抗性。