2种猪冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RT-PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49copies/μL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性。该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RTPCR方法检测结果无显著性(P0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

猪Delta冠状病毒的流行病学调查及M基因序列分析

为了解猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)在发生腹泻疫情猪群中的感染情况,根据PDCoV M基因的保守序列设计了一对检测引物,建立了猪Delta冠状病毒的的检测方法,其最低核酸检测限量为3.92×10~3 copies/μL,特异性和灵敏度均较好。利用该方法对2015—2017年上海周边猪场的518份猪腹泻粪便样品进行检测,检测出25份PDCoV阳性样品,阳性感染率达4.8%。在所检出的阳性样本中,PDCoV与猪嵴病毒(Porcine kobuvirus,PKV)和猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)的混合感染率较高,分别为40%和48%;PDCoV与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)混合感染率为8.0%,未检测到PDCoV与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TEGV)混合感染的样本。随机选取10份PDCoV阳性样本,对扩增的M基因片段同源性进行分析,结果发现,10份样品中核苷酸同源性达95.0%—99.6%,与GenBank登录的PDCoV毒株的同源性为96.1%—100%,说明目前流行的PDCoV毒株的遗传差异不大,该研究可为了解PDCoV流行情况提供参考依据。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

为了建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)快速、特异的检测方法,减少猪流行性腹泻(PED)给养猪业带来的损失,根据PEDV的S基因序列设计1对引物,优化扩增条件,建立了针对PEDV的RTPCR检测方法。结果显示,建立的检测方法可特异地检测出PEDV。应用建立的检测方法对2016年河南地区38家发生腹泻的猪场的256份病料进行检测,结果表明,阳性猪场为30家,阳性样本为157份,检出率高于试纸条检测方法。可见,建立的检测方法特异性强,可用于PEDV感染疑似病例的诊断及流行病学调查。     

猪诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

为了解中国猪群中猪诺如病毒感染情况,本研究根据猪诺如病毒保守的RNA依赖性RNA多聚酶(RNA Dependent RNA Polymerase,RDRP)基因序列设计了一套巢式RT-PCR引物,用该引物从猪粪便样品中扩增出与预期目的产物大小一致的条带,经克隆、测序后获得的序列与GenB ank数据库序列比对,证明所扩增的序列属于猪诺如病毒,表明本研究成功建立了猪诺如病毒巢式RT-PCR检测方法。该检测方法具有高特异性和敏感性,应用该方法检测某猪场健康育肥猪粪便样品,阳性率为54.5%。通过RDRP基因进行核苷酸同源比对发现本文获得的猪诺如病毒Wuning 1株属于GII群诺如病毒,与美国猪诺如病毒毒株OH-QW101/03/US、中国猪诺如病毒毒株Norovirus pig/GII/Ch6/China/2009核苷酸序列同源性最近。值得注意的是猪诺如病毒Wuning1毒株与武汉人诺如病毒毒株E2120/CHN/2010核苷酸同源性高达77.1%,说明猪诺如病毒Wuning 1毒株与武汉人诺如病毒基因组上亲缘性较近。本研究成功建立了一种检测猪诺如病毒的巢式RT-PCR方法,并应用于临床猪粪便样品的检测,为猪诺如病毒的诊断与监测提供了可供借鉴的方法、为猪诺如病毒的进化、分子病毒学及与人诺如病毒关系的深入研究提供依据。     

猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中的猪水泡病病毒(SVDV)高度保守的VP1基因的序列,设计了与SVDV互补的2对特异性引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选,成功地扩增出251bp和366bp特异性条带,将其克隆入pMD18-T载体中,并进行序列测定,与已发表的SVDV基因比较发现,核苷酸的同源性为100%,证实为SVDV的VP1段基因。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等,对照的扩增结果均为阴性,验证其特异。对SVDVRNA进行10倍系列稀释后检测,结果SVDVRNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性,说明具有较好的敏感性。此项试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。     

猪传染性胃肠炎及流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的序列,利用Primer 5.0设计合成了2对特异性引物。用这2对引物对TGEV、PEDV cDNA模板首先进行单项PCR条件优化,然后采用正交试验设计优化多重RT-PCR反应条件,结果同时扩增到2条与实验设计相符的492bp(PEDV)和211bp(TGEV)特异性条带,建立了能够同时检测2种病毒混合感染的特异、灵敏的多重PCR检测方法,可检测出约11pg的PEDV和13pg的TGEV。     

猪库布病毒RT-PCR检测方法的建立及湖北省流行病学初步调查

根据猪库布病毒的3 D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3 D基因和口蹄疫病毒3 D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测。敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL。应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性。在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示,猪库布病毒在猪群中集中分布在发生腹泻疫情的猪群,说明猪库布病毒和现阶段的腹泻疫情有紧密的联系。     

猪IL-12p40竞争定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪IL-12p40的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增377 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含IL-12p40部分基因片段的重组质粒. 利用反向PCR技术构建与扩增377 bp片段共用同一对引物但扩增255 bp片段的竞争重组子. 通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立了猪IL-12p40的标准竞争曲线和直线回归方程.     

检测猪源牛病毒性腹泻病毒荧光RT-PCR方法的建立与监测分析

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′-UTR保守序列建立的特异性荧光RT-PCR,对采自福州市周边屠宰场的359份屠宰猪血清进行BVDV感染的病原学检测。结果待检的359份血清样品BVDV阳性52份,阳性率为14.5%(52/359)。对其中13份BVDV阳性样品5′端UTR片段进行序列测定分析,发现所测13份BVDV阳性样品5′端UTR片段均与VEDEVAC进化谱系较为密切,均为基因Ⅰ型。以上结果表明以牛源BVDV建立的特异性荧光RT-PCR方法适用于猪源BVDV感染的监测,并揭示福州市屠宰猪存在BVDV感染。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

【目的】 利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒（PEDV）自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95.8%—97.1%。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基因,其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300 bp ,而弱毒疫苗株则为250 bp左右;该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增,其敏感性可达到100TCID50/0.1mL,对仔猪腹泻临床样品检测结果显示,PEDV自然感染的阳性率为65.4%。【结论】 初步建立了基于PEDV ORF3基因的RT-PCR鉴别诊断方法,该方法可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株,为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速的检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

根据文献合成1对针对PRRSV毒株ORF6基因高度保守序列的引物,建立用于检测PRRSV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR诊断方法.提取PRRSV-LC病毒RNA,经所建立的荧光定量RT-PCR方法扩增,可获得特异的扩增曲线,而日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒(PCV)进行同条件检测,结果为阴性;方法可检测到1 TCID_(50) PRRSV,比琼脂糖凝胶电泳敏感度高10～100倍.结果表明,所建立的PRRSV荧光定量RT-PCR诊断方法特异性好、敏感性高,可进一步应用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和科学研究.     

实时荧光定量RT-PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立

[目的]建立Taqman探针荧光定量RT-PCR检测传染性胰脏坏死病病毒（IPNV）的方法。[方法]选取IPNV病毒的基因保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物与探针。以梯度稀释的含有IPNV目的扩增片段的质粒作为标准品,探索定量RT-PCR反应条件。[结果]当标准品浓度在102～106 copies/μl之间时,标准品浓度（X）与Ct的关系为Ct=-3.426 lgX＋4.481,相关系数R2为0.999 8。该法对病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）、鲤春病毒血症病毒（SVC）和流行性造血器官坏死病病毒（EHNV）,草鱼呼肠孤病毒（GCRV）,大鳞大麻哈鱼胚胎细胞（CHSE-214）和虹鳟的核酸都没有扩增反应。[结论]该检测方法灵敏度高,特异性好,可用于鱼类传染性胰脏坏死病病毒的快速定量检测。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立

【目的】克隆猪cDNA,作为猪LPL mRNA定量检测的标准品,建立检测方法。【方法】用RT-PCR,从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA,将纯化的LPL cDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR 检测。纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPL mRNA实时定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为1×103 ～1×1010拷贝,阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（R2＝0.9871）。【结论】成功克隆了LPL实时荧光PCR定量标准,且TaqMan荧光定量RT-PCR的方法可对猪背最长肌LPL mRNA的表达进行准确定量。     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

Establishment of Real-Time TaqMan-Fluorescence Quantitative RT-PCR Assay for Detection and Quantification of Porcine Lipoprotein Lipase mRNA

Porcine lipoprotein lipase （LPL） cDNA was cloned as the standard for real-time quantifying LPL mRNA and the TaqMan-fluorescence quantitative PCR assay for detection was established. The total RNA extracted from Longissimus dorsi of porcine was reverse-transcribed to cDNA. LPL cDNA was ligated with pGM-T vector and transformed into Escherichia coli TOP10. Plasmid DNA extracted from positive clones was verified by PCR amplification and sequenced. LPL was amplified by real-time fluorescence quantitative PCR from the plasmid DNA. The concentration of DNA template purified was detected by analyzing absorbance in 260 nm and then the combined plasmid was diluted to series as standard for fluorescence quantitative PCR （FQ-PCR）. The method of LPL mRNA real-time PCR was well established, which detected as low as 103 with the linear range 10^3 to 10^10 copies. The standard curves showed high correlations （R2 = 0.9871）. A series of standards for real-time PCR analysis have been constructed successfially, and real-time TaqMan-fluorescence quantitative RT-PCR is reliable to quantitatively evaluate FQ-PCR mRNA in L. dorsi of porcine.     

PCV2套式PCR检测方法的建立及应用

根据猪圆环病毒2型GD株及已发表的PCV2的全基因组序列,设计1对PCV2型特异性引物,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18-T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中,提取质粒进行套式PCR、酶切、测序鉴定,结果扩增出了PCV2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在90%以上。用该PCR方法对287个猪场的1 560份样品进行了检测,其中983份为PCV2阳性,阳性率为63%。     

猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

基于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的N基因,建立了PEDV的TaqMan探针RT-PCR检测方法。以标准质粒绘制log10拷贝数与Ct之间标准曲线的线性相关系数值为0.996,检测灵敏度为100拷贝/μL,对传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒和圆环病毒2型等几种猪病毒的检测结果均为阴性,批内和批间的变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性。对不同代次细胞培养上清中的病毒样品进行检测,结果表明该方法能够满足PEDV野毒株分离过程中的病毒定量检测需要。     

猪代尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其S基因分子特征分析

猪代尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一个新发现的致病性猪肠道冠状病毒,目前在中国部分省份养殖场的腹泻病猪中已检测到,并已证实在中国流行。本研究旨在探明PDCoV在浙江省的流行现状和分子演化特征。结果显示,建立的PDCoV一步法TaqMan探针荧光定量检测方法特异,检测灵敏度可达3.94×10²拷贝·μL^-1,扩增效率为108%,R²值为0.997,标准曲线方程为Y=-3.156X+1.826。2013年4月—2016年12月收集的258份仔猪临床腹泻样本中没有检测到,但在2017年1—4月检测阳性率达到50%(12/24)。获得的7个临床分离株的S基因与参考株相比,其核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.98%~100%和99.99%~100%;与最初在香港分离到的毒株和美国流行株相比,存在3个碱基缺失和一定数量的突变。以S蛋白进行分子演化分析,发现7株临床分离株均在代尔塔冠状病毒属进化分支上,且与中国分离到的其他PDCoV毒株在进化关系上较近,与美国、泰国等地分离到的PDCoV在进化关系上较远,提示PDCoV的流行株分布有一定的地域性。研究结果提供了浙江省地区PDCoV临床分离株的基因特性,为防控PDCoV引起的仔猪腹泻、加快流行株疫苗的开发提供了数据。     

牛病毒性腹泻/黏膜病RT-PCR 3种体系的试验研究

根据牛病毒性腹泻/黏膜病病毒5′端非结构蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,建立检测牛病毒性腹泻/黏膜病病毒244 bp片段的RT-PCR 3种体系。该3种体系对牛病毒性腹泻/黏膜病病毒NADL、Oregon C24V和长春184毒株各标准毒株的检测结果均为阳性。对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达0.1 TCID50;而对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的细胞培养物进行检测,结果均为阴性。证明3种体系方法特异性强,敏感性高。初步结果表明所建立的RT-PCR技术3种体系可用于牛病毒性腹泻/黏膜病的检测及流行病学调查。