牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用

【目的】布鲁氏菌virb8蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8基因的原核表达载体,利用纯化蛋白作为包被抗原,建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA方法（iELISA）。【方法】根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌Virb8序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增Virb8的基因,将目的基因克隆入PEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-Virb8,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,利用所建立的iELISA方法对235个临床奶牛血清样本进行检测,并与虎红平板凝集实验进行比较。【结果】成功构建了含Virb8的表达载体,经多次对表达条件的优化,大量表达了目的蛋白,建立的iELISA方法具有稳定、灵敏的特点,与虎红平板凝集试验的符合率可达97.02%。【结论】所建立的iELISA方法是一种有效的牛布鲁氏菌病血清学诊断的方法,为进一步研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。     

检测牛轮状病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用

以田间分离的轮状病毒CHLY(G6型)作为抗原,建立了犊牛轮状病毒(BRV)抗体检测与监测的间接ELISA方法.田间监测牛轮状病毒感染率为32.91%(26/79),疫苗源性抗体高峰出现在二次免疫后第40天至第60天,抗体持续期为3个月.该方法可用于粪便、血清样品的检测,具有特异性强、快速简便等优点,适合于对轮状病毒特异性抗体的动态监测和批量检测.     

LH抗体间接ELISA检测方法的建立

以高纯度的促黄体素（LH）作为包被抗原,建立了检测LH抗体的间接ELISA法,该法的最适抗原包被浓度为1μg/mL,最佳酶标山羊抗小鼠抗体稀释度为1∶1500.该法只与LH阳性小鼠血清呈现阳性反应,而与LH阴性小鼠血清和小鼠促卵泡素（FSH）阳性血清呈现阴性反应.结果表明,该法具有良好的特异性和重复性,可用于LH免疫后抗体水平检测.     

检测禽霍乱抗体间接ELISA法的建立

以方阵滴定法选择出最适ＥＬＩＳＡ反应条件,用系列稀释法测定２１份血清样品的禽霍乱抗体ＥＬＩＳＡ效价（ＥＴ）,并与相应血清样品１：２００倍稀释的Ｐ／Ｎ值配对,作线性回归分析,得到回归方程ｙ＝２１９．６７３ａ－１８３．５７０（ｒ＝０．９４４）和标准曲线,从而建立起快速定量测定禽霍乱抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法－阳阴比值ＥＬＩＳＡ效价法（Ｐ／ＮＩ－ＥＴ法）利用该法,血清样品只需作１：２００倍稀释,测定其Ｐ／     

牛病毒性腹泻/黏膜病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测牛病毒性腹泻、黏膜病病毒抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白并纯化,使用纯化后的蛋白作为包被抗原。确定最佳抗原包被浓度为6μg·m L-1,最佳血清稀释度为1∶80,最佳包被液为碳酸缓冲液,最佳盐封闭液为5%脱脂乳,最佳血清作用时间为60 min,酶标抗体作用最佳浓度为1∶10 000;最佳底物作用时间为5 min,阳性临界值为D450 nm≥0.282。与IDEXX的BVDV间接ELISA试剂盒比较,总符合率为91.5%,板内和板间重复性试验变异系数均小于10%。该方法与牛副流感病毒Ⅲ型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛冠状病毒阳性血清无交叉反应。因此,该ELISA诊断方法可用于大批量样本抗体水平监测和流行病学调查。     

间接ELISA检测抗犬瘟热病毒抗体方法的建立

以大肠杆菌表达的犬瘟热病毒(CDV)重组核蛋白(GST-NP)经纯化后作为包被抗原,通过方阵ELISA滴定确定GST-NP的适宜包被浓度为1.31 μg·mL-1,并由此建立检测抗CDV抗体的间接ELISA方法.通过对已知抗CDV阳性血清及抗其他病毒血清的试验,表明所建立的间接ELISA可特异检测动物血清中的抗CDV抗体.另外,通过不同样品的重复试验以及不同批次的检测试验,证明该方法在用于检测CDV抗体时具有很好的重复性和稳定性.     

检测兔出血症病毒抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法,应用杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被浓度为4.62μg/ml,标准阴、阳性血清稀释度为1∶200,封闭液选用2%明胶;羊抗兔IgG最佳稀释度为1∶4 000。阻断试验、特异性试验、敏感性试验、重复性试验结果显示,该方法具有较高的特异性、敏感性和重复性。用建立的ELISA方法与血凝抑制试验对临床血清样品进行检测,结果显示,ELISA与HI检测兔血清的RHDV抗体阳性率分别为84.7%(955/1 127)和76.0%(857/1 127),符合率为91.3%。该方法的建立为检测RHDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、快速、操作简便经济的检测方法,为兔出血症免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。     

PRRSV血清抗体间接ELISA检测方法的建立

用亲和层析纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白GST-N作为诊断抗原,建立检测PRRS血清抗体的间接ELISA方法。抗原最佳包被量为每孔400 ng,待检血清最佳稀释度为1∶100,待检血清样品的D_(490 nm)≥0．43D_(po■) 0．57D_(neg)判为阳性,反之判为阴性。对采自14个猪场的364份猪血清样品进行检测,PRRS阳性率为51．4%,略高于HerdChek ELISA的阳性检出率49．7%。与HerdChek ELISA相比,间接ELISA的敏感性为94．5%,特异性为91．3%,总符合率为92．9%,Youden指数为0．86。同时还证明该方法具有良好的批间和批内重复性,并且不与猪瘟、猪伪狂犬病等阳性血清发生反应。该方法的成功建立将为我国PRRS的防制工作作出贡献。     

鸡源黄病毒卵黄抗体间接ELISA检测方法的建立

为在检测产蛋鸡黄病毒抗体水平过程中减少应激,以鸡源黄病毒FQ-C1株为包被抗原,建立检测鸡源黄病毒卵黄抗体的间接ELISA方法.确定的优化条件是包被抗原浓度为5.7 ng·μL-1,卵黄抗体以1∶160倍稀释,羊抗鸡IgG酶标抗体以1∶3 200稀释.经特异性、敏感性检验表明该方法特异性强、敏感性高,适合于产蛋鸡免疫后的抗体检测.     

仙台病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以纯化pQE31表达的融合蛋白仙台病毒EP（S）为诊断抗原、融合蛋白FP（S）免疫鼠血清为阳性抗体,建立了小鼠仙台病毒抗体检测的间接ELJSA诊断方法。该抗原FP（S）不与其他常见的小鼠病毒（小鼠肝炎病毒、鼠痘病毒、小鼠肺炎病毒和呼肠孤病毒Ⅲ型）的阳性缸清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于7％,与中国药品生物制品检定所的试剂盒符合率为98％。本研究建立的检测仙台病毒抗体的间接ELISA诊断方法,有很好的特异性和敏感性,为仙台病毒的抗体的检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

测定RHDV抗体的间接ELISA方法的建立

通过氯仿和PEG6000处理,SephadexG 200层析纯化RHDV抗原,建立了检测RHDV抗体的间接ELISA试验方法。该方法的抗原最适包被浓度为10μg/ml,血清样品最佳稀释度为1∶400。与血凝抑制试验方法(HI)等相比,该方法具有快速、简单、特异性和重复性好等优点。     

检测禽霍乱抗体间接ELISA法的建立

以方阵滴定法选择出最适ＥＬＩＳＡ反应条件,用系列稀释法测定２１份血清样品的禽霍乱抗体ＥＬＩＳＡ效价（ＥＴ）,并与相应血清样品１∶２００倍稀释的Ｐ／Ｎ值配对,作线性回归分析,得到回归方程ｙ＝２１９．６７３ａ－１８３．５７０（ｒ＝０．９４４）和标准曲线,从而建立起快速定量测定禽霍乱抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法——阳阴比值ＥＬＩＳＡ效价法（Ｐ／ＮＩ－ＥＴ法）。利用该法,血清样品只需作１∶２００倍稀释,测定其Ｐ／Ｎ值,通过回归方程（或标准曲线）即可求得ＥＴ．     

抗氯吡脲单克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA方法的建立

在获得高特异性抗CPPU单克隆抗体的基础上,采用活性酯法将CPPU-H1与BSA、CPPU-H2与OVA偶联制备得到免疫抗原CPPU-H1-BSA和包被抗原CPPU-H2-OVA;用CPPU-H1-BSA对小鼠进行免疫,通过杂交瘤技术筛选获得了1株抗CPPU单克隆抗体的杂交瘤细胞株B7B6 24。经过体内诱生腹水法制备抗体,测定抗体亚类为Ig G1,效价为1∶32 000。通过对试验条件的优化,建立了一种检测CPPU的方法 ,该方法 IC50值为3.89 ng/m L;该抗体与四螨嗪、赤霉素、噻苯隆几乎不存在交叉反应;利用所建立的间接竞争ELISA法对葡萄样品进行检测,平均加标回收率为91.4%~112.4%,变异系数为5.9%~14.4%。本研究所建立的间接竞争ELISA方法具有低成本、高准确性和高灵敏度的特点,可以用来对葡萄中的CPPU残留情况进行检测。     

猪圆环病毒Ⅱ型抗体间接ELISA检测方法的建立

建立了检测猪圆环病毒2型血清抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床血清样品的检测.用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的核衣壳(capsid,Cap)基因,将该基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-Cap,将该重组质粒转化宿主菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3),用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白cap分子质量为42 ku,可与6×HIS抗体反应;KCl预染切胶纯化目的蛋白,以其为抗原建立检测PCV2感染猪血清抗体的间接ELISA方法.ELISA检测5份血清样品结果变异系数均小于10%.用该方法分别检测湖北、河南等地的91份临床血清样品,阳性率为25%～100%.上述结果表明,所制备的目的蛋白具有较高的纯度和良好的免疫原性,所建立的间接ELISA检测抗体方法,具有良好的重复性,初步临床试用效果良好.     

副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的上呼吸道病原菌,引起格拉瑟氏病,主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病,通常见于5—8周龄的青年猪,发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型,目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型,是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒,为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白,使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,优化间接ELISA反应条件,并组装试剂盒。在此基础上,确定该试剂盒的敏感性、特异性;通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测,评价该试剂盒的实用性;在以上临床血清样本中随机选取200份,分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测,比较检测结...     

猪瘟病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

以猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)标准强毒石门株为模板,RT-PCR扩增CSFV E2基因N端的主要抗原区(△E2).PCR产物定向克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-AE2,转化Eacterium coli BL21-Codonplus(DE3),IPTG诱导重组△E2蛋白表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达.KCl预染切胶法纯化△E2蛋白,以其为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了CSFV抗体ELISA检测方法.用该方法对331份临床血清进行检测,并与IDEXX公司阻断ELISA试剂盒进行了相符性验证,符合率为74%.为研制猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础.     

猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法的建立

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列设计特异性引物,进行PCR反应,回收PCR产物,将其克隆入pMD18-T载体,再定向克隆到表达载体pET-32a中并转化大肠杆菌Rosetta,进行原核表达.表达产物经His-Bind蛋白纯化试剂盒纯化,平均浓度为1.10 mg/ml.以1.8 μg/ml蛋白包被酶标板,建立ELISA检测方法.建立的ELISA方法与北京世纪元亨公司试剂盒比较,两者检测结果符合率达85%以上.用该方法对常州某猪场36份母猪和156份10～160日龄猪群血清样品进行了检测,检测结果显示母猪阳性率为81.4%,仔猪阳性率随着日龄的增加而逐渐降低,之后由于受PCV-2的感染,阳性率逐渐升高.本试验建立的ELISA方法,具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于猪群PCV-2抗体的大规模检测.     

羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

[目的]研制基于Eg95重组蛋白为检测抗原的羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒。[方法]以细粒棘球蚴Eg95重组蛋白为检测抗原,筛选间接ELISA的最佳反应条件,确定ELISA的判定标准,检测敏感性和重复性,组成、包装试剂盒并初步应用。[结果]建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,检测阳性血清和阴性血清的准确率均为100%。[结论]研制的羊棘球蚴(包虫)病ELISA抗体检测试剂盒可用于细粒棘球蚴Eg95亚单位疫苗抗体水平的检测。