紫杉醇生物合成相关酶类的研究进展

紫杉醇(Taxus)是一种从红豆杉植物中提取出来的天然抗癌药物。笔者简要介绍了紫杉醇的化学结构和生物合成途径, 重点介绍了紫杉二烯合成酶、细胞色素P450单加氧酶、酰基转移酶和苯丙氨酸氨基变位酶等紫杉醇生物合成相关酶类的研究进展。     

化感水稻PI312777响应低磷胁迫的差异蛋白质组学分析

为研究水稻响应低磷的分子机理,以化感水稻PI312777为材料,应用差异蛋白质组学方法分析化感水稻PI312777根部响应低磷的蛋白质组变化趋势.结果表明,共鉴定11个差异蛋白质点,共分为3类:第1类,与信号转导相关蛋白质-细胞色素B5、受体激酶;第2类,与生长相关蛋白质-推定叶绿体SPR接受子、CDC2蛋白激酶、生长素转运蛋白、脯氨酸富集蛋白家族;第3类,与化感物质代谢相关蛋白质-推定水杨酸羧基转甲基酶、推定4-香豆酸辅酶A连接酶、推定细胞色素P450、苯丙氨酸解氨酶、角鲨烯单氧化酶.其中除细胞色素B5和角鲨烯单氧化酶表达丰度下调,其余蛋白质表达丰度均上调.     

工程大肠杆菌高效转化外源脂肪酸生成羟基脂肪酸的研究

细胞色素P450单加氧酶(P450BM3)能特异性催化脂肪酸ω碳位羟基化反应生成羟基脂肪酸,在前期构建携带单加氧酶基因P450BM3工程大肠杆菌(Escherichia coli)转化脂肪酸的基础上,为解决外源脂肪酸在羟基化过程中的消耗和转运问题,构建了脂酰基辅酶A合成酶基因(fadD)缺失和外膜蛋白编码基因(fadL)过表达的工程菌株。摇瓶条件下羟基十二酸产量达到748.8 mg/L,转化率为93.6%。     

细胞色素氧化酶P450介导的昆虫抗药性研究进展

细胞色素氧化酶P450介导的昆虫抗药性研究有利于延缓或防止昆虫对杀虫剂产生抗性,延长杀虫剂的使用寿命。基于此,简要介绍昆虫细胞色素氧化酶P450的研究情况,以及昆虫抗药性与细胞色素氧化酶P450的关系,并对细胞色素P450介导抗性的分子基础进行介绍。     

利用RNAi技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素P450

【目的】通过体外饲喂双链RNA（dsRNA）,利用RNAi技术沉默麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450。【方法】采用PCR克隆获得麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450片段;利用双链RNA合成试剂盒合成麦长管蚜和桃蚜细胞色素P450保守序列的dsRNA;在蚜虫人工饲料中,分别加入终浓度为0、3、5和7.5 ng•μL-1的dsRNA,每个试验组设置3个重复,分别于饲喂后2天、4天、6天、8天统计蚜虫的存活数;利用实时荧光定量PCR技术分析饲喂后目标基因的表达抑制情况。【结果】从麦长管蚜与桃蚜的cDNA中分别克隆细胞色素P450,所克隆片段同源性为90.1%,发现随着dsRNA浓度的增大,麦长管蚜和桃蚜的死亡率随着时间的推移不断升高,最高死亡率可分别达75.56%和64.44%。提取饲喂dsRNA浓度为7.5 ng•μL-1的不同时间段的蚜虫总RNA,实时荧光定量PCR结果表明,目的基因被沉默。【结论】利用麦长管蚜和桃蚜细胞色素P450保守序列的dsRNA,体外饲喂后,通过RNA干扰（RNAi）,能够显著降低蚜虫体内细胞色素P450的表达水平,直至导致目的基因沉默和蚜虫死亡。     

矮牵牛细胞色素b5蛋白编码基因difF的克隆及序列分析

以紫红色、蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)的花瓣为材料,提取总RNA,用Oligo(dT)作为引物反转录合成cDNA第一链:以此为模板,用Genebank上的矮牵牛细胞色素b5蛋白DIF-F(difF)的mRNA序列设计成的引物进行PCR扩增,扩增到一条约450 bp的片段,将此片段克隆到pGM-T载体上.对重组克隆进行序列分析,结果表明所克隆到的矮牵牛细胞色素b5蛋白的cDNA的编码区含有450个核苷酸,编码149个氨基酸残基;其核苷酸及氨基酸的序列与Genebank上的同源性分别达到99.93;和100;.     

人参皂甙Rbl对大鼠神经细胞表达蛋白质组的影响

[目的]研究人参皂甙Rbl对大鼠神经细胞表达蛋白质组的影响。[方法]常规培养大鼠神经细胞,将其随机分为2组,试验组加入5μg/ml Rbl,对照组加入等量的培养基,药物作用20 min,裂解细胞,提取全细胞蛋白。双向电泳(2-DE)分离提取物,用ImageMaster2D Platinum v5.0软件进行差异表达蛋白质组分析,基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达蛋白质。[结果]通过对2-DE图谱蛋白斑点的匹配及对比分析,试验组的2-DE图谱共检出蛋白斑点418个,其中226个为差异表达的蛋白斑点;经质谱鉴定,与Rbl作用相关的2个差异表达的蛋白斑点包括:细胞色素P-450、光导素样蛋白,它们均属于磷酸化蛋白质。[结论]该研究表明Rbl对大鼠神经细胞的作用极有可能是通过相应的细胞信号转导网络系统来实现的。     

棉铃虫CYP4家族基因片段克隆及序列分析

以5龄实验室品系棉铃虫的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增并筛选出10个新的长度约450bp的cDNA片段,并对这些序列与GeneBank中已知序列进行相似性分析,初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。     

两个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的克隆与分析

为了深入研究入侵生物扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)对农药等外源物的作用机制,采用RACE的方法克隆了2个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的开放阅读框序列.其中一个基因的开放阅读框包含1 536 bp的片段,编码512个氨基酸,其相对分子质量为59 843.5,理论等电点为8.79,推测属于稳定存在的蛋白,且没有跨膜区域;其具有WXXXR(WKNLR)、EXXR(ETLR)序列及FXXGXXXCXG/A(FGEGPRICIG)血红色素结合位点等细胞色素P450特有的氨基酸序列,其中ETLR属于CYP6家族所特有,且其blast比对均与昆虫体内CYP6A家族的相似性较高,将其命名为PsCYP6a1.另一个基因的开放阅读框包含1 575 bp的片段,编码525个氨基酸,相对分子质量为61 246.62,理论等电点为8.87,推测属于稳定存在的蛋白,且没有跨膜区域;与前者相似,也包含了相应的细胞色素P450基因的保守位点,将其命名为PsCYP6a2.2个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的核苷酸序列的相似性为55.56%,氨基酸序列的相似性为39.41%,相似的残基占了44.12%.     

烟实夜蛾细胞色素P 450 cDNA片段的克隆与序列分析

昆虫细胞色素P 450与昆虫抗药性关系密切,本研究以烟实夜蛾5龄幼虫中肠的总RNA为模板,设计并合成简并引物,利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出了烟实夜蛾细胞色素P 450基因的cDNA片段,将其克隆到pMD 18-T载体进行序列测定,测序得到的491 bp的片断编码163个氨基酸残基,且该片断在阅读框内.与已公布的谷实夜蛾、棉铃虫和烟芽夜蛾细胞色素P 450氨基酸序列进行比较,其一致性分别为98.7%,98.7%和92.1%.     

毛竹香豆酸-3-羟基化酶基因的克隆与表达研究

香豆酸-3-羟基化酶（C3H）是木质素单体合成中的一个关键酶。采用文库筛选的方法从毛竹萌发种子全长cDNA文库中克隆了1个C3H基因,命名为PheC3H.PheC3H基因全长1 842 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码1个由513个氨基酸残基组成的蛋白（PheC3H）,C端具有1个细胞色素P450蛋白（CYP450）特异的保守结构域。相似性比对显示, PheC3H与其他植物的C3H有着较高的相似性,其中与小麦的CYP98A蛋白相似性最高,达91.2%;聚类分析表明,PheC3H属于CYP98A亚家族蛋白;实时定量PCR结果表明,PheC3H在一年生实生毛竹叶鞘中表达量最高,其次是在根中,在叶片和茎中表达量相对较低。     

一个毛竹细胞色素P450基因的克隆与表达研究

从毛竹全长cDNA文库中分离到1个细胞色素P450基因,命名为PheCYP-1。相似性分析表明,其编码蛋白与拟南芥CYP706A亚家族蛋白相似性较高(42%~46%),属于CYP706家族;实时定量PCR结果表明,PheCYP-1在正在伸长的笋中表达丰度最高;将PheCYP-1构建到pBI121的多克隆位点,在拟南芥中过量表达,转基因拟南芥的次生木质部导管壁厚度显著增加,表明PheCYP-1基因可能与毛竹次生木质部的细胞壁发育有关。     

福建南方红豆杉提取紫杉醇初探

本文初步测定了福建南方红豆杉中紫杉醇含量实验采用甲醇或无水乙醇作浸提剂，在室温条件下连续搅拌分别浸提试样得粗浸提液，经离心分离，取精浸提液减压蒸发得粗提取物，用二氯甲烷萃取，减压蒸发得红豆杉浸膏．ＨＰＬＣ法测定紫杉醇含量，其中紫杉醇的质量分数在树皮中为３８×１０－４，木材中为７６×１０－５，小枝叶中为５２×１０－５     

基于高紫杉醇质量分数的东北红豆杉优良种源选育

从东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb.et Zucc)国内主要分布区选取8个种源,分别在3个地点开展了种源试验,测定了12年生东北红豆杉根皮紫杉醇质量分数。结果表明,东北红豆杉不同种源间紫杉醇质量分数差异极显著(P<0.01),大兴沟种源紫杉醇质量分数最高(22.767μg/g),是最低种源(和龙)的1.69倍,因此选育出高紫杉醇质量分数的东北红豆杉优良种源——大兴沟种源。各种源紫杉醇质量分数与地点间存在显著的交互作用(P<0.01),说明某一种源紫杉醇质量分数会因立地条件和气候不同而变化。东北红豆杉优良种源适宜在吉林省中东部地区种植,在空气湿润、pH值小于7.0的沙壤土上生长良好。可采用播种和扦插方式繁殖苗木,营林方式以林下造林较好,以3～5株/穴块状造林方式最佳。     

Human dioxin-inducible cytochrome P1-450: complementary DNA and amino acid sequence

Induction of cytochrome P1-450 has been linked to susceptibility to certain chemically induced cancers in mouse and man. Treatment of the human cell line MCF-7 with 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) results in high levels of aryl hydrocarbon (benzo[a]pyrene) hydroxylase (P1-450) activity. This cell line was used to isolate a human P1-450 full-length complementary DNA (cDNA) clone. The cDNA is 2566 nucleotides in length, encodes a polyadenylated messenger RNA (2.8 kilobases in length), and has a continuous reading frame producing a protein with 512 residues (molecular weight, 58,151). The human P1-450 cDNA and protein are 63 percent and 80 percent similar to mouse P1-450 cDNA and protein, respectively. Whereas the mouse TCDD-inducible P-450 gene subfamily has two members (P1-450 and P3-450), the human TCDD-inducible gene subfamily appears to have only one gene (P1-450).     

东北红豆杉扦插繁殖技术研究

针对东北红豆杉扦插成活率低、生长速度慢等问题,对东北红豆杉扦插繁殖技术进行研究。采取药用维生素B12处理2年生插穗,用优质腐质土作插床,控制温、湿度和水分,适度遮荫,可使扦插成活率达95%以上,解决东北红豆杉扦插成活率低的难题;移栽后施用有机肥料香油渣,可大幅度提高幼苗生长量,解决红豆杉生长速度慢的难题。     

不同采收期东北红豆杉枝叶中紫杉醇含量分析

[目的]通过检测不同季节不同年生野生和栽培东北红豆杉枝叶中紫杉醇的含量及干物质得率确定其最佳采收期,使其药用价值得到充分的利用,为仿生东北红豆杉实现工业化生产提供理论指导。[方法]采用RP-HPLC法,TOSOH C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm)流动相为乙腈-0.2 mol/L乙酸铵-冰醋酸(41∶59∶0.2),流速为1 ml/min,检测波长为230 nm,柱温为25℃。[结果]野生和仿生东北红豆杉中紫杉醇含量最高时期在4、5月份。[结论]该方法用于紫杉醇的测定简单,快速,准确,可用于东北红豆杉枝叶中紫杉醇的含量测定。     

指纹图谱技术研究红豆杉组织中紫杉烷的积累规律

对红豆杉提取物HPLC指纹图谱的构建进行了研究，并应用指纹图谱技术从色谱相似度软件评价和直接观察图谱两方面，探讨紫杉烷类化合物在红豆杉组织的分布及随季节变化的规律。结果显示，中国红豆杉与穗花杉、曼地亚红豆杉的色谱相似度为0．326和0．865，而同株红豆杉中树皮与枝叶、种子以及冠瘿组织的色谱相似度分别为0．965、0．932和0．322，表明已建立的指纹图谱的技术和评价方法能合理地反映植物和组织间的化学成分差异，提示紫杉烷类的空间分布在红豆杉正常组织间无明显差异，红豆杉中紫杉烷的含量在一年四季处于动态的变化，这种变化受气温、湿度、降雨量和光照等气象指标的综合影响。     

不同浓度GA_3处理和不同温度层积对东北红豆杉种子胚形态变化的影响

以东北红豆杉种子为试验材料,采用两因素试验,通过不同浓度GA3处理、不同温度层积处理,研究东北红豆杉种子胚形态变化,以探讨打破东北红豆杉种子休眠的有效途径,保护东北红豆杉资源。试验结果表明：结合GA3处理进行不同温度层积处理,东北红豆杉的种胚长度和宽度与处理前相比都有明显增加,GA3200mg/L处理结合变温层积效果最好,说明赤霉素处理结合变温层积能有效的促进东北红豆杉种胚形态后熟。