抗褐飞虱和抗除草剂转基因粳稻新品系的选育及其中间试验

利用根癌农杆菌介导法,将位于同一双元载体pCUGNA-BAR上的GNA基因和Bar基因导入粳稻品种广陵香粳,获得了转基因品系.经PCR扩增检测和Southern杂交分析证明GNA基因已整合到转化植株的基因组中.在转化后代中选育了一个表现优异的转基因水稻新品系3015-1-1进行中间试验,田间农艺性状调查发现该品系3015-1-1基本保持了未转化对照优良的农艺特性.抗虫和抗除草剂试验表明, 3015-1-1对褐飞虱的蜜露排泄量和繁殖率具有显著的抑制作用,对除草剂Basta有明显抗性.     

转Wx-cDNA基因水稻无抗性选择标记植株的筛选

本试验以直链淀粉含量不同的粳稻品种武香9915和糯稻品种苏御糯、广陵香糯为受体材料,运用根癌农杆菌介导的双载体共转化技术分别将含有潮霉素抗性(HPT)选择标记基因和Wx-cDNA的2个T-DNA区序列导入上述受体中,获得了大量转基因水稻植株。对转基因水稻植株进行PCR检测,结果表明:目的基因和潮霉素抗性选择标记基因可以共整合到细胞中,并可以在后代中发生分离,从而可以筛选出仅含有目的基因而不含选择标记基因的转基因植株。     

Na~+转运蛋白SKC1基因转化大豆的研究

本研究构建了水稻Na+转运蛋白SKC1基因植物表达载体pTF-SKC1,标记基因为Bar基因。以子叶节为外植体,利用农杆菌介导法将SKC1导入大豆中。经过除草剂抗性筛选后获得的再生植株经PCR方法鉴定,转基因植株阳性率为50%,初步证明SKC1基因已整合到大豆基因组中。耐盐性试验结果表明,转基因植株的耐盐性高于对照。     

转Cry1A(b)基因抗虫水稻的获得及鉴定

利用农杆菌混合液介导的共转化法,研究不同浓度的农杆菌混合液浸染5种水稻品种的愈伤组织,进而获得共转化再生植株。对转基因植株进行叶片潮霉素抗性检测和螟虫田间抗性鉴定的结果表明,农杆菌混合液浓度OD600为0.6左右时,其浸染能力较强;5个品种中以浙粳27的再生效率最高。转基因植株叶片经潮霉素抗性检测,潮霉素阳性率为78.13%,经PCR检测转基因植株Cry1A(b)基因阳性率为15.11%。自然抗性鉴定结果表明:Cry1A(b)基因阳性的转基因植株对稻纵卷叶螟具有很好的抗性。基因分离的鉴定结果表明:HPT基因与Cry1A(b)基因在共转化转基因植株的后代中发生了分离。     

去除标记基因的水稻转基因研究

以p1300(含潮霉素抗性标记基因)和p13W8(含反义蜡质基因)为供体DNA，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的方法，对水稻品种寒丰B的幼胚愈伤组织进行共转化，获得35份转基因植株。经PCR检测，有5份检测到反义蜡质基因和潮霉素抗性基因共存。在其T1代材料中，通过PCR检测获得24份只带有反义蜡质基因而无潮霉素标记基因的转基因植株。结果证明：在共转化植株后代中，通过筛选可获得无抗性标记基因的水稻转基因植株。     

籼稻R996转Pi9基因纯系的筛选及稻瘟病抗性鉴定

采用农杆菌介导法将抗稻瘟病Pi9基因导入籼稻品种R996,获得转基因植株,并对这些转基因植株进行遗传分析。结果表明:Pi9基因已经整合到受体细胞基因组中,并在转录水平上得到了有效表达;对转基因植株后代进行潮霉素抗性、GUS染色和PCR检测分析,鉴定出Pi9基因阳性转化子;经稻瘟病抗性鉴定,从T1代符合孟德尔分离比(1∶2∶1)的分离群体中,成功筛选出转Pi9基因的籼稻R996纯系。     

农杆菌转化花粉愈伤组织获取纯合的转基因水稻植株

应用农杆菌介导法成功地将玉米转座子Ds导入粳稻(OryzasattvaI.subsp.japontca)中花11的花粉愈伤组织中,基因转化以对除草剂PPT有抗性的Bar基因和潮霉素抗性基因Hpt为选择标记.共获得了18个独立的转基因绿苗,其中单倍体11株,二倍体7株.转基因植株均抗除草剂BASTA.考查了二倍体植株种子后代(T1)对BASTA的抗性,7个株系的所有植株均抗BASTA,而未发生感抗分离,表明外源基因在转基因植株中是纯合的.PCR和Southernblotting的研究支持上述结果.对获得纯合转基因株系的各种方法做作了比较和讨论.     

转稻瘟病抗性基因Pi-d2水稻的主要农艺性状和米质研究

[目的]对农杆菌介导转化获得的稻瘟病抗性基因Pi-d2的水稻植株稳定后代的主要农艺性状和米质进行了分析,以期为转基因水稻的生态学和安全性评价提供依据。[方法]在田间调查了转Pi-d2基因水稻植株的主要农艺性状,并对转基因水稻稻米理化特性和氨基酸含量进行测定。[结果]外源基因Pi-d2的导入可引起受体植株后代农艺性状可遗传的变异。大部分转基因植株生长正常,整齐一致,与对照相比,一半左右植株株高表现显著差异;分蘖数、穗长、有效穗、结实率和千粒重与对照相比无明显差异,少部分表现增加或减少的趋势。稻米的氨基酸测定结果表明转抗病基因水稻改变了原亲本的总氨基酸含量,呈下降趋势,但淀粉含量、胶稠度和糊化温度并未改变。[结论]将Pi-d2基因转入水稻中对植株株高影响明显,但对稻米的理化特性影响不大。     

草莓FaAP1基因植物表达载体构建及在拟南芥中的超表达

为研究草莓AP1同源基因FaAP1的功能,构建了其植物表达载体pBI121-FaAP1,并导入到农杆菌菌株GV3101中。利用花序浸染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了3个转化株系。结果显示,与对照相比,转基因株系明显早花,成花时间可提早10d以上;同时其营养生长受到抑制,植株个体矮小,莲座叶数目减少;在早花的同时,转化株系花器官异常,不能形成种子。表明草莓FaAP1基因参与了成花过程的调控。     

转稻瘟病抗性基因Pi-d2水稻的主要农艺性状和米质研究(英文)

[目的]对农杆菌介导转化获得的稻瘟病抗性基因Pi-d2的水稻植株稳定后代的主要农艺性状和米质进行了分析,以期为转基因水稻的生态学和安全性评价提供的依据。[方法]在田间调查了转Pi-d2基因水稻植株的主要农艺性状,并对转基因水稻稻米理化特性和氨基酸含量进行测定。[结果]外源基因Pi-d2的导入可引起受体植株后代农艺性状可遗传的变异。大部分转基因植株生长正常,整齐一致,与对照相比,一半左右植株株高变高或矮。分蘖数、穗长、有效穗、结实率和千粒重与对照无明显差异,少部分表现增加或减少的趋势。稻米的氨基酸测定结果表明转抗病基因水稻改变了原亲本的总氨基酸含量,呈下降趋势,但淀粉含量、胶稠度和糊化温度并未改变。[结论]转Pi-d2基因入水稻中对植株株高影响明显,但对稻米的理化特性影响不大。     

Breeding of Selectable Marker-Free Transgenic Rice Lines Containing AP1 Gene with Enhanced Disease Resistance

In order to obtain marker-free transgenic rice with improved disease resistance, the AP1 gene of Capsicum annuum and hygromycin-resistance gene （HPT） were cloned into the two separate T-DNA regions of the binary vector pSB130, respectively, and introduced into the calli derived from the immature seeds of two elite japonica rice varieties, Guangling Xiangjing and Wuxiangjing 9, mediated by Agrobacterium-mediated transformation. Many cotransgenic rice lines containing both the AP1 gene and the marker gene were regenerated and the integration of both transgenes in the transgenic rice plants was confirmed by either PCR or Southern blotting technique. Several selectable marker-free transgenic rice plants were subsequently obtained from the progeny of the cotransformants, and confirmed by both PCR and Southern blotting analysis. These transgenic rice lines were tested in the field and their resistance to disease was carefully investigated, the results showed that after inoculation the resistance to either bacterial blight or sheath blight of the selected transgenic lines was improved when compared with those of wild type.     

转苋色藜NDR1基因水稻的获得及对白叶枯病抗性的初步研究

NDR1(non-race-specific disease resistance)基因能介导植物广谱抗病,在植物的防御反应中发挥重要作用。以特色抗病植物苋色藜为材料,克隆并鉴定了NDR1的同源基因Ca NDR1a和Ca NDR1b。在此基础上,利用该基因分别构建植物表达载体,农杆菌介导转化法获得转基因水稻,经PCR和Southern杂交证明外源基因已整合到水稻基因组中。选取部分株系进行水稻白叶枯病抗性鉴定,记录接种后3 d、5 d、10 d的叶片病斑长度,结果表明:转Ca NDR1a、Ca NDR1b基因水稻对白叶枯病具有一定的抗性,可延迟发病。外源基因在转基因水稻植株中均有较高水平表达,但抗病性较好株系Ca NDR1基因的表达量并非最高。农艺性状调查结果显示多数转基因植株株高较对照组矮,但结实率、千粒重等农艺性状与对照组相比并无显著差异。     

玉米PEPC基因和抗白叶枯病基因Xa25的水稻聚合育种

利用转玉米PEPC基因水稻HPTER(高感水稻白叶枯病)和抗白叶枯病水稻HX-3(具有抗白叶枯病基因Xa25)杂交,获得F1杂种,并对F1杂种进行花药培养,获得42株二倍体植株。通过对这些植株后代进行抗白叶枯病性鉴定,PEPC酶活性和光合速率测定及PCR检测,最后获得同时具有玉米PEPC基因和抗白叶枯病基因Xa25的水稻聚合株系7个,这些株系的农艺性状较HPTER有较大改善,可作为培育高产、抗白叶枯病水稻新品种的种质资源。     

转Hpa110-42小麦分子鉴定及赤霉病抗性功能评价

【目的】筛选出抗赤霉病转Hpa110-42小麦植株,为抗赤霉病小麦新品种的选育提供材料。【方法】以转Hpa110-42小麦T2植株和受体扬麦158为供试材料,通过PCR、Southern blotting、RT-PCR等分子技术进行外源基因的整合与表达检测,并采用单花滴注法鉴定转基因小麦的赤霉病抗性,同时探讨其抗性生理。【结果】经分子检测证明,外源Hpa110-42以1—3个拷贝整合到小麦基因组中并能够稳定遗传,在转录水平上也能正常表达。赤霉病抗性鉴定表明,株系T2-17、T2-15、T2-68、T2-44和T2-36的平均病小穗率极显著低于扬麦158。除T2-17外,其余株系的平均病小穗率极显著高于苏麦3号,均未达到苏麦3号的抗性水平。T2-17株系平均病小穗率显著低于T2-15、T2-68和T2-44,极显著低于T2-36、T2-11和T2-20株系。抗性生理分析显示,接种赤霉菌孢子后,所有植株的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性均上升,但转基因高抗植株比扬麦158上升更快,而感病株上升相对缓慢;尽管可溶性蛋白含量呈下降趋势,但转基因植株的高抗植株始终高于其它株。β-1,3-葡聚糖酶活性和可溶性蛋白含量与赤霉病抗性等级值呈极显著负相关。【结论】外源Hpa110-42整合到小麦基因组中,能稳定遗传并正常表达,正向参与了小麦赤霉病抗性调控,获得了抗赤霉病转Hpa110-42小麦植株。     

转基因水稻外源基因的遗传和表达初步研究

将天蚕抗菌肽B基因应用基因枪法导入水稻TN1发芽肿胚，获得转基因植株2株，转基因水稻T1－T5 5个世代不同株系，对bar基因、抗菌肽基因的遗传和表达进行初步研究。结果表明：转基因后代株系bar^R:bar^S在部分符合3：1分离比率。T1、T4转基因株系PCR、Southern印迹分析表明，T18株有抗菌肽B基因；T4仍有4个株系有抗菌肽基因，其他的株系基因丢失，T3 1个株系Northern印迹证明抗菌肽基因在RNA水平有表达；抗菌肽B转基因水委对白叶枯病的抗病性有提高，抗性能传递到高世代，在T3得到抗病性提高的株系。     

Xa21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体 ,经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因 Xa2 1导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系 SWR2 0中 ,共获得 4 3个独立的转基因株系 ,1 0 0余株转基因水稻植株。经 GUS活性、潮霉素抗性检测及PCR分析表明 ,外源基因已整合到转基因水稻基因组中 ;白叶枯病原菌接种试验表明 ,大部分 T0 代转基因水稻植株的抗病性有明显提高 ,多数植株表现抗或高抗 ,个别为感病。经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后 ,GUS瞬间表达率可高达 92 .5% ,稳定转化频率达到 2 7.6%     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

转基因水稻抗纹枯病性的杂种优势与配合力

用2个雄性不育系和5个转几丁质酶基因抗病品系按NCTI设计配制10个杂交组合,研究了转基因杂交水稻的杂种优势和配合力效应。结果表明,转基因水稻各抗性指标的一般配合力达极显著水平,但一般配合力的高低与其抗病性的强弱并不完全相关,而与其组合抗性呈极显著正相关;转基因杂交稻抗纹枯病性的超亲优势强度小,但组合间抗性差异极显著,病级和病情指数的特殊配合力也达极显著水平;转基因杂交稻抗纹枯病性遗传力高,受加性和非加性遗传共同控制,以加性遗传较为重要,源于转基因父本的加性效应明显高于不育系母本的加性效应。转基因水稻E14-1和Pin4具有较好的一般配合力效应,在抗病育种中有较大的利用价值;杂交组合Hai 3S／Pin 4和GD1／E14-1特殊配合力效应突出,是初步筛选出的优良抗性组合。     

水稻基因Os922的克隆、转化及对葡萄糖的敏感性研究

通过PCR方法从水稻cDNA文库中克隆到1个水稻AP2/EREBP类的转录因子基因Os922,并构建增强表达载体CoU-Os922.使用光照共培养方法将根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转化到粳稻(Oryza sativa L.)秀水11的幼胚,得到转基因水稻植株.对所得潮霉素抗性水稻植株的PCR和Southern blot分析表明,Os922基因已整合到受体基因组中.T1代转基因植株根的生长被葡萄糖抑制,表现出对葡萄糖的敏感性,表明Os922基因可能与糖信号传导有关.