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相似文献
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1.
【目的】提供一种基于 96 孔板的水稻根部 DNA 提取技术,可显著提升 DNA 提取效率。【方法】 在 96 孔深孔板的每个孔中放入一粒萌发的种子,在深孔板下方对应放置 96 孔 PCR 板,在适当光温下促使水稻 根伸入 PCR 板中;当水稻幼苗发育至一叶一心时,将 PCR 板移至干冰与 95% 乙醇混合液体中,利用冷冻处理 捕获幼根;用改良的 TRIS-EDTA 法批量提取 DNA 并进行浓度和纯度检测。【结果】从播种到根部组织样品的 获取全部在 96 孔板中进行,实现了样本组织的批量获取及目标个体的精确对应。改良的 TRIS-EDTA 法提取 96 个水稻样本 DNA 的效率显著高于传统的 CTAB 法。【结论】基于 96 孔板的水稻根部组织批量获取及 DNA 高效 提取方法,对于提升水稻分子育种效率具有实践意义。  相似文献   

2.
陈臣  任婧  艾连中  刘振民 《南方农业学报》2012,43(10):1443-1446
【目的】建立快速定性、定量检测益生菌产品中植物乳杆菌菌株ST-III的方法,为其实际应用提供参考。【方法】根据植物乳杆菌菌株ST-III与NCBI库中3株已知序列的植物乳杆菌全基因组序列差异,设计菌株特异性引物,进行菌株特异性PCR验证和定性检测;然后建立荧光定量PCR,并检测益生菌制品中菌株ST-III含量。【结果】设计的引物具有良好的菌株特异性;经PCR扩增,含有ST-III的检验样本出现预期特征条带,与预期目的片段(242 bp)相近。建立的荧光定量PCR标准曲线方程为y=-3.369lgx+39.84,R2为0.9990,符合Real-time PCR定量的要求,其检测限为2.85×103 CFU/mL。经检测,样品中植物乳杆菌ST-III的数量分别为3.25×105、1.28×106、4.55×106 CFU/mL。【结论】建立的植物乳杆菌菌株ST-III定性、定量检测方法快速灵敏、测定时间短,可以在实际生产中应用。  相似文献   

3.
 【目的】建立玉米群体混合样本等位基因及其频率的分析方法。【方法】采用ABI全自动遗传分析仪,利用5′端荧光标记的SSR引物,通过混合样本中PCR扩增产物检测峰高与丰度对应,分析基因频率。【结果】与聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法相比,ABI全自动遗传分析仪的检测灵敏度高。20个供试玉米群体中,荧光引物Phi072(6-Fam)共检测到82个等位基因位点,平均每个群体4.1个;引物Phi084(Hex)检测到43个等位基因位点,平均每个群体2.15个。多重PCR(multiplex PCR)荧光SSR检测结果显示,可以明确区分不同等位基因。荧光SSR能准确地读出片段大小,定量PCR扩增产物的丰度。用GeneScan获取数据,用Genotyper软件对数据进行设置与输出,使用R软件的FREQS-R模块,初步探讨利用荧光SSR定量化数据,计算供试群体15个单株混合样本的等位基因频率。【结论】可通过荧光SSR产物的丰度来确定混合取样群体的基因频率。  相似文献   

4.
转基因玉米种子的PCR检测   总被引:2,自引:2,他引:0  
以PCR技术为基础,建立了检测玉米种子中转基因成分的方法。对提取的基因组DNA进行PCR以扩增玉米内源基因zSSIIb,设计了常见的CaMV 35 S启动子、NOS终止子、Bar终止子、Bt,进行了初步的定性筛选,并用Bt176对阳性结果进行验证,结果表明:这是一套转基因玉米定性PCR检测方法,具有较高的准确性、可靠性,可以用于转基因玉米种子及其产品的筛查、抽检。  相似文献   

5.
以PCR技术为基础,建立了检测玉米种子中转基因成分的方法。对提取的基因组DNA进行PCR以扩增玉米内源基因zSSIIb,设计了常见的CaMV 35 S启动子、NOS终止子、Bar终止子、Bt,进行了初步的定性筛选,并用Bt176对阳性结果进行验证,结果表明:这是一套转基因玉米定性PCR检测方法,具有较高的准确性、可靠性,可以用于转基因玉米种子及其产品的筛查、抽检。  相似文献   

6.
【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No. MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109~1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48~86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。  相似文献   

7.
鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立   总被引:2,自引:2,他引:0  
 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。  相似文献   

8.
为筛选适宜的DNA混合池法,采用两因素交叉分组设计,以混合样本数量(20、60和150个)和终质量浓度(50、100和150 ng/μL)为组合因子,分析不同混合池对PCR扩增质量及SNPs检出率的影响。结果表明:在同一混合样本数量下,以终质量浓度100 ng/μL建立的DNA混合池扩增的PCR产物纯度和OD_(260)/OD_(280)均优于50 ng/μL,但对测序结果无显著影响;以终质量浓度150 ng/μL建立的DNA混合池扩增的PCR产物杂带较多,不符合测序要求。在同一混合样本终质量浓度下,混合样本数越多,SNPs检出率越高。综上,从PCR扩增质量、SNPs检出率和试验成本来分析,以混合样本150个、终质量浓度100 ng/μL组合建立的DNA混合池效果最好。  相似文献   

9.
精子与慢病毒共孵育条件的优化以及转基因猪的制备   总被引:2,自引:0,他引:2  
【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为:100 µL慢病毒原液(5×105cfu)与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子(109个/mL)给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件(100 µL慢病毒原液(5×105cfu)与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min),成功制备了转基因猪,并检测有外源基因的融合。  相似文献   

10.
【目的】建立牛肉及中式加工品中猪肉成分的定性、定量检测方法,保障牛肉产品的纯正性。【方法】提取猪肉及不同加工猪肉制品中的猪基因组DNA,通过DNA质量检测,PCR扩增,灵敏度试验,分析加工方式对猪DNA质量、灵敏度和检测限的影响;制备生牛肉和经干、蒸、煮、炖、煎、炸、烤制处理的牛肉制品中掺入不同比例(10%、5%、1%、0.1%)猪肉的二元混合肉,进行普通PCR和荧光定量PCR定性定量检测,探索DNA在掺假鉴别中的应用。【结果】不同加工方式下猪DNA质量检测结果显示,不同加工方式显著影响DNA纯度(P0.05),生猪肉及7种猪肉制品中DNA纯度(A260nm/A280nm)范围为1.893—1.977,高于理论值1.8;DNA含量范围为110—277μg·g-1,经加工处理的猪肉制品的DNA含量显著高于生猪肉处理组(P0.05);琼脂糖电泳结果发现,放置6个月后生猪肉和7种肉制品的DNA严重降解,但生猪肉依然能获得一些不清晰的长片段DNA,而7种肉制品的猪DNA全部降解为小片段DNA,说明长时间放置和热处理明显影响了猪DNA的完整性;猪肉制品中DNA的降解虽然严重,经普通PCR扩增线粒体基因,所有样品的PCR产物均呈现为清晰且单一的条带,可见从加工肉制品中提取的DNA可以开展灵敏度试验和掺假检测试验;灵敏度试验结果显示普通PCR是高度敏感的,经10倍梯度稀释,8个试验组样品中提取的猪DNA最低检测限均为0.005 ng;荧光定量PCR扩增猪DNA所得Ct值形成的标准曲线也具有良好的线性关系,其标准曲线斜率处在-3.1—-3.7,决定系数R2值均大于0.99,PCR扩增效率处在89%—100%,且定量PCR最低能够检测出0.005 ng的猪DNA。掺假样品定性定量PCR检测结果显示,除炸制混合肉(为1%)外,混合生肉及其他6种混合肉制品的定性检测试验最低检测限均为0.1%,说明普通PCR可检测微量的猪肉成分;混合肉的定量试验中根据不同掺假比例所建立的8个试验组标准曲线的决定系数R20.99,斜率为-3.1—-3.6,各曲线均具有良好的线性关系,可以实现牛肉中猪肉成分的定量检测;对比生肉与肉制品的定量结果,混合生肉与混合肉制品的标准曲线的截距之间存在约0.01—0.6个循环数的差异。【结论】不同加工处理能够显著影响肉中DNA的含量、纯度和完整性,但不影响肉制品中DNA的检测限和灵敏度,普通PCR和定量PCR均可以检测到极微含量的掺假肉成分。可见,基于PCR技术的检测方法灵敏度高、速度快、特异性强,定量检测标准曲线有较高的线性相关性和扩增效率,可为肉类行业质量控制和检验计划以及验证标签声明提供可靠的依据,可应用于一些商业样品,以保证肉制品的纯正性。  相似文献   

11.
【目的】从大麦BAC文库中快速筛选包含目的基因HvGW2的阳性BAC克隆。【方法】构建BAC文库三维混合池,设计2对HvGW2特异性引物,进行BAC文库筛选,对含有目的基因HvGW2的阳性BAC克隆进行测序,获得编码大麦GW2蛋白的基因组DNA序列,并与禾本科中的GW2进行同源进化分析。【结果】构建了大麦BAC文库的三维混合池160个,文库空载率为0.18%;筛选到含HvGW2的阳性BAC克隆3个,其中,BAC克隆196M02包含完整编码该基因的序列;HvGW2包含8个外显子和7个内含子,具有与其它植物GW2相似的结构特征和保守的功能结构域;同源进化分析结果显示,大麦与小麦的GW2蛋白同源性最高;序列分析发现,HvGW2第6内含子上包含2个不同类型的反转录转座子插入,从而使大麦比其它作物的GW2长度增加11.5 kb以上。【结论】通过构建三维混合池快速筛选包含目的基因的单个阳性BAC克隆,建立了大麦目标基因克隆的辅助平台;HvGW2基因组中位于内含子区的反转录转座子插入导致基因长度增加,可能是影响该基因转录水平的关键变异。  相似文献   

12.
【目的】喹诺酮类药物和庆大霉素均为高效、广谱抗菌药物,对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果,是中国畜牧业和水产业中常用的两类兽药。由于这两类药物在动物源性食品中的残留可能导致对人类健康的危害,因此,为了保护消费者的健康,研究和制定动物源性食品中同时检测这两类药物的残留检测方法对完善中国的食品安全监测体系具有重要意义。【方法】建立了同时检测牛奶中13种喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并对喹诺酮类和庆大霉素单克隆抗体按比例进行混合标记。同时,采用方阵法系统研究了胶体金标记这两类抗体时的pH值和抗体用量对灵敏度的影响,并对这两类药物抗原的包被条件进行选择确定。在此基础上研发出可同时检测牛奶中13种喹诺酮类药物和庆大霉素的胶体金快速检测试纸条,试纸条采用直接竞争法原理。【结果】该方法可同时检测恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氟甲喹、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、噁喹酸、麻保沙星、氟罗沙星、奥比沙星、达氟沙星和洛美沙星这13种喹诺酮类药物和庆大霉素,对其他喹诺酮类药物如:沙拉沙星、二氟沙星、司帕沙星、帕珠沙星等无交叉反应,同时对其他氨基糖苷类药物如:链霉素、新霉素、卡那霉素等也无交叉反应。该试纸条对牛奶中这13种喹诺酮类药物和庆大霉素的检测限均为20 ng·mL-1,完全满足国家对这两类药物的残留限量要求。牛奶样本直接检测,无需处理,整个检测过程5 min内完成。【结论】采用该方法和HPLC-MS/MS对60份牛奶盲样进行比对试验,阳性样品全部检出,同时筛选方法未出现假阳性和假阴性现象,二者的测定结果基本相符,表明该方法准确可靠,适用于现场大批量样本的快速检测和筛选。实际操作过程中,可以采用胶体金免疫层析对样品进行现场快速初筛;筛选的疑似阳性样品,可以采用HPLC-MS/MS方法对样品中QNS和GEN的含量进一步确认。  相似文献   

13.
Bt杀虫蛋白在转基因抗虫棉中的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】评价转基因抗虫棉的生物安全性。【方法】利用3个由花粉管通道法获得的转Bt基因的抗虫棉品系,通过Southern杂交技术研究了抗虫棉的插入数,通过棉铃虫饲喂、半定量RT-PCR和ELISA测定了抗虫棉的Bt杀虫活性的时间和空间的动态变化。【结果】Bt基因在抗虫棉中为1~2个拷贝数;Bt蛋白杀虫活性的时空动态表现为在不同生育期的同一器官中,苗期叶片的表达比花铃期的叶片强,在同一生育期内,不同器官表达不同,叶片和铃壳的表达高于苞叶、花和雌雄蕊。【结论】Bt杀虫蛋白在转基因抗虫棉中的抗性具有时空表达特异性。  相似文献   

14.
【目的】研究转Bt基因抗虫棉对棉蚜的个体生长发育及繁殖能力的影响。【方法】在室内研究转Bt基因棉(处理)和常规棉(对照)对棉蚜个体生长发育及繁殖能力的影响。【结果】转Bt基因抗棉铃虫棉对棉蚜发育速度、成蚜寿命、4龄若蚜体重、成蚜繁殖力无明显影响。【结论】取食转Bt基因棉花对棉蚜个体生长发育没有负面影响,转Bt基因棉花对棉蚜生长发育和繁殖是安全的。为转Bt基因抗虫棉对棉蚜的生态安全性评价提供相关依据。  相似文献   

15.
【目的】研究一起放牧羊群布鲁氏菌病(布病)分析检测方法适用性,为防治措施提供依据。【方法】采用RBT、GICA、SAT、MAT、FPA、iELISA、cELISA和PCR等方法检测90份来自流产羊群的血清样品,并从诊断方法的适用性特点、现场调查的结果进行统计分析。【结果】在90份羊血清样品中,RBT、GICA、SAT、MAT、FPA、iELISA、cELISA的阳性检出率分别为:8.89%(8/90)、12.22%(11/90)、17.78%(16/90)、14.44%(13/90)、21.11%(19/90)、25.56%(23/90)、24.44%(22/90),PCR检测出14份阳性。【结论】初筛可选用RBT、GICA、FPA或iELISA等方法,确诊选用SAT、MAT或cELISA等方法。放牧羊群布病阳性率随年龄增加呈上升趋势(成年羊42%>断奶羔羊2.5%);雌性羊布病阳性率高于雄性(雌性29.68%>雄性11.54%),有流产史的羊群患布病的风险更高,成年雌性羊更易感染布鲁氏菌。检出阳性羊进行无害化处理,羊舍和周围环境进行彻底消毒,使用布病M5-90弱毒疫苗对阴...  相似文献   

16.
 摘要: 【目的】通过测定纯种亲本大白猪、长白猪、梅山猪及其正反交大白猪×长白猪、长白猪×大白猪、大白猪×梅山猪和梅山猪×大白猪等杂种猪血液和肌肉组织DNA甲基化含量,分别比较基于不同杂交组合和不同组织,亲本与子代之间在DNA甲基化含量上的差异,为揭示杂种优势的分子机制提供依据。【方法】采用高效液相色谱法测定血液和组织中甲基化含量。【结果】经过测定及计算,163份肌肉组织样平均甲基化含量为16.92%;182份血液样平均甲基化含量为6.49%,两者之间差异达到了极显著水平(p<0.01)。在相同组织不同杂交组合中杂种后代表现不同。同样地,在相同杂交组合不同组织之间杂种后代表现也不尽相同。【结论】杂种甲基化含量升高,可能是利用甲基化关闭了一些影响生长的不利基因的表达。杂种甲基化含量的变化表现为杂交组合和组织特异性。  相似文献   

17.
 【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减 cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg?kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减 cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。  相似文献   

18.
转Bt(Cry1Ab)基因对水稻光合特性及光合产物积累的影响   总被引:3,自引:2,他引:1  
 【目的】明确外源Bt基因插入对水稻倒1叶光合速率及光合作用相关生理特性的影响。【方法】以转Bt基因水稻及亲本水稻为试材,研究盆栽及田间条件下转Bt基因及亲本水稻苗期、拔节期、抽穗期和成熟期倒1叶光合特性及其相关光合酶活性、光合产物积累的动态变化。【结果】转Bt基因及亲本水稻生理活动峰值均出现在拔节期。与亲本水稻相比,转Bt基因水稻苗期叶片净光合速率显著低于亲本;而拔节期和抽穗期,转Bt基因水稻倒1叶净光合速率、叶绿素含量和乙醇酸氧化酶活性显著高于亲本水稻(P<0.05),且拔节期转Bt水稻倒1叶气孔导度和胞间CO2浓度也显著高于亲本水稻(P<0.05);成熟期,转Bt基因与亲本水稻倒1叶光合特性无显著性差异(P>0.05)。【结论】与亲本水稻相比,外源Bt基因的插入对水稻叶片光合特性产生短暂影响,但这种影响不具有持续性。  相似文献   

19.
 【目的】Bt(Bacillus thuringiensis)玉米(Zea mays L.)是全球商品化程度最快的抗虫转基因作物之一,协调利用其内在防御机制和人工导入抗性是目标害虫抗性风险综合管理和第2代抗虫转基因作物培育的主要策略之一。【方法】采用基因表达分析、化学物质分析和ELISA蛋白定量方法,研究外施信号物质茉莉酸对Bt玉米34B24 (Mon810)及其同源常规玉米34B23幼苗叶片直接防御物质含量及其相关基因表达的影响。【结果】外源茉莉酸处理能诱导34B24和34B23处理叶(第1叶)中LOX、PR-2a、MPI和PR-1基因的表达,第1叶丁布含量分别比对照增加63%和18%、总酚含量分别增加24%和12%。茉莉酸处理使34B24第1叶中的Bt蛋白含量增加了13%,但第2叶中的显著降低了27%。与34B23相比,茉莉酸对34B24的诱导作用更强,并具有系统性。【结论】人工外施茉莉酸的条件下,Bt玉米人工导入抗性(Bt基因)和自身化学防御过程之间的互作关系是协同的。  相似文献   

20.
【目的】研究转cry1Ab杀虫蛋白基因玉米收获后玉米根茬及其根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态,比较两种Bt玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定玉米收获后根茬残体和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态。【结果】转Bt基因玉米根茬残体和根际土壤中杀虫蛋白是逐渐降解的,Bt玉米MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较高,降解的速度也较慢,收获后8个月时还不能完全降解;Bt玉米Bt11根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较低,降解速度比MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度快,到7个月时已检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。Bt玉米MON810根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解较Bt11的慢,MON810和Bt11根际土壤分别在8个月和7个月时检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。【结论】种植过Bt11和MON810抗虫玉米的田块,在第二年春播农作物已经出土时,其根茬和根际土壤中残留的Cry1Ab杀虫蛋白尚不能完全降解,还有少量残留。  相似文献   

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