异三聚体G蛋白在IAA诱导的拟南芥根生长发育中的作用

以拟南芥的野生型（ws）和异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体（gpa1-1,gpa1-2）和超表达突变体（wGα,cGα）为材料,通过施加不同浓度（0~0.8 mg/L）的IAA处理,对拟南芥根生长发育的一些形态指标进行了观测比较。结果表明：①随着培养基中IAA浓度的不断升高,5种基因型主根的伸长生长都受到抑制,且抑制作用随浓度升高而增强;4种突变体和野生型主根的生长在相同浓度IAA处理下,无明显差异;②IAA在一定浓度范围内,对拟南芥侧根的生长发育起促进作用;在相同浓度IAA诱导的侧根生长中,缺失突变体明显比野生型侧根多,超表达突变体比野生型侧根少。初步证明,G蛋白不参与主根生长发育的调节,而在侧根生长发育中可能起负调节作用。     

Ca2+对拟南芥侧根生长发育影响的递进因子分析

【目的】确定Ca2+在异三聚体G蛋白调控的拟南芥侧根生长发育过程中的作用及可能的信号传递途径。【方法】以拟南芥的野生型(ws)、异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体(gpa1-1,gpa1-2)和超表达突变体(wGα,cGα)为材料,在含有不同质量浓度(0~0.2 mg/L)NAA的培养基内,添加无机钙通道抑制剂AlCl3,对拟南芥侧根生长发育的形态进行观测,并对NAA、Ca2+、AlCl3的影响作用大小进行递进因子分析。【结果】相同质量浓度的NAA对5种基因型拟南芥侧根的生长发育无显著影响;Ca2+对5种基因型拟南芥侧根生长发育均有显著影响,侧根数目依次为缺失突变体野生型超表达突变体;AlCl3对5种基因型拟南芥侧根生长发育影响显著;Ca2+和AlCl3是拟南芥侧根生长发育的重要影响因素。【结论】(1)Ca2+通道可能是异三聚体G蛋白α亚基调节的下游效应器,Ca2+可能是下游信号,AlCl3对细胞膜上的Ca2+通道阻断数量可能是按一定比例阻断,而不是一个绝对数量,机制尚不明确。(2)3个处理因素在不同的处理层次中所起的作用不同,对5种不同基因型拟南芥个体侧根生长的影响也不同。递进因子分析结果与实际情况基本一致,是一种科学的、可行的、有创新性的方法,值得推广应用。     

ABA在拟南芥种子萌发和幼苗发育中的作用

采用不用浓度ABA处理各种基因型的拟南芥种子,结果表明:拟南芥abi1和abi2是ABA信号的负调节者;异三聚体G蛋白α亚基gpa1基因超表达株系和T-DNA插入突变体在种子萌发和幼苗发育中对ABA不敏感;相对于野生型来说,a/c、a/g表现出相对的ABA不敏感性,表明在ABA抑制的种子萌发和幼苗发育过程中gap1可能位于abi1上游。     

异三聚体G蛋白参与小麦抗叶锈病反应的研究

 【目的】研究异三聚体G蛋白是否参与小麦抗叶锈病反应的过程，为更深入地了解小麦抗叶锈病的反应机制奠定基础。【方法】用异三聚体G蛋白的效应剂处理离体培养的小麦叶片后接种叶锈菌观察侵染型的变化。测量经异三聚体G蛋白的效应剂诱导后防卫反应酶活性值，观察变化趋势。另外用半定量RT-PCR方法检测接种毒性菌株和无毒性菌株后异三聚体G蛋白α亚基基因的表达情况。【结果】用激活剂（GTPγS、Mastoparan-7）处理后明显可以推迟叶片发病,而抑制剂百日咳毒素（PTX）作用不明显。用G蛋白的激活剂（GTPγS、Mastoparan-7）处理后防卫反应酶的活性升高，而用抑制剂百日咳毒素（PTX）处理后24 h再接种无毒性叶锈菌菌株，防卫反应酶的活性却无明显的变化。无毒性叶锈菌菌株可以诱导叶片中G蛋白基因表达量升高，毒性菌株抑制G蛋白基因的表达。【结论】异三聚体G蛋白可能参与了小麦抗叶锈病的反应过程。     

异三聚体G蛋白在2,4-D诱导的拟南芥根生长发育中的作用

利用拟南芥的野生型(ws)、异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体(gpa1-1和gpa1-2)和超表达突变体(wGα和cGα)为材料,通过施加不同质量浓度(0～0.010 mg.L-1)的2,4-D处理,对拟南芥根生长发育的形态指标进行了测定。结果表明:(1)随着培养基中2,4-D质量浓度的不断增大,5种基因型主根的伸长生长都受到抑制,且抑制作用随浓度升高而增强;4种突变体和野生型主根的生长在相同浓度2,4-D处理下,无明显差异;(2)2,4-D在一定浓度范围内,对拟南芥侧根的生长发育起促进作用;在2,4-D诱导的侧根生长中,相同浓度2,4-D处理下,缺失突变体明显比野生型侧根多,超表达突变体比野生型侧根少;gpa1-1和gpa1-2分别在2,4-D质量浓度为0.005mg.L-1和0.008 mg.L-1时的侧根数目与野生型差异最大。初步证明G蛋白不参与2,4-D诱导的拟南芥主根生长发育的调节,而在侧根生长发育中可能起负调节作用。     

磷脂酰肌醇3-磷酸对UV-B诱导蚕豆保卫细胞中过氧化氢产生和气孔关闭的影响

【目的】研究磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）催化产物磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）对紫外线B（UV-B）诱导保卫细胞中过氧化氢（H2O2）产生和气孔关闭的影响,为进一步阐明植物细胞转导UV-B辐射信号的机制提供依据。【方法】以蚕豆（Vicia faba L.）表皮条为材料,采用PI3K的抑制剂沃曼青霉素（WM）和LY294002（LY）来抑制PI3P的形成,采用二苯基碘（DPI）和水杨基氧肟酸（SHAM）分别抑制H2O2形成的NADPH氧化酶途径和细胞壁过氧化物酶途径,通过气孔开度分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,确定PI3P在0.8 W•m-2 UV-B辐射诱导蚕豆保卫细胞H2O2产生和气孔关闭中的作用。【结果】WM和LY能显著抑制UV-B诱导的保卫细胞H2O2产生和气孔关闭;外源H2O2处理能显著逆转WM和LY对UV-B诱导气孔关闭的抑制效应,但WM和LY不能抑制外源H2O2诱导的气孔关闭;UV-B诱导的保卫细胞H2O2产生和气孔关闭能被活性氧清除剂和SHAM显著抑制,但不能被DPI抑制。【结论】PI3P通过诱导蚕豆保卫细胞中产生于过氧化物酶途径的H2O2形成来介导UV-B辐射诱导的气孔关闭。     

拟南芥二氧化碳突变体生理特性的分析

[目的]对2个已获得的拟南芥突变体：二氧化碳敏感突变体（cds1）和二氧化碳不敏感突变体（cdi1）进行一些生理特性分析,寻找它们同野生型之间的差异表型。[方法]利用表皮条生物学试验方法对拟南芥野生型和突变体叶片进行气孔开度、气孔密度和叶片失水率测定,同时采用培养基中添加脱落酸（ABA）、甘露醇（Man）和NaC l作为胁迫处理测定种子萌发率。[结果]2个突变体气孔密度同野生型基本一致,而气孔开度和叶片失水率则有明显差异。此外,种子萌发试验也表明cdi1对外源ABA、甘露醇和NaC l不敏感,而cds1则刚好相反。[结论]2个突变体同野生型之间生理特性存在一定的差异。     

拟南芥G蛋白突变体gpa1-1、gpa1-2形态及生理特性分析

对拟南芥野生型Ws及其G蛋白α亚基突变体gpa1-1和gpa1-2的形态特征进行了比较，并研究了低温处理对其抗氧化酶系活力和丙二醛含量的差异。结果表明，与野生型相比，两突变体形态上发生了较大的变化，并表现出对低温反应敏感性的降低。低温12h时，野生型的SOD酶和POD酶活迅速发生变化，丙二醛含量迅速升高，而两突变体变化较平缓。     

G蛋白在暗调控气孔运动中的作用

通过药理学试验和暗诱导调控的蚕豆叶片气孔运动变化分析,来证明异源三聚体GTP-结合蛋白(G蛋白)参与暗诱导的气孔关闭过程.结果表明,百日咳毒素能够阻止暗诱导的气孔关闭,而该效应同样可被H2O2清除剂维生素C、过氧化氢酶所实现.表明暗中活化的G蛋白水平较高,G蛋白与H2O2共同在暗诱导的气孔关闭中作为信号分子参与其中.     

MAP18参与了脱落酸调控的拟南芥气孔关闭及根生长

以拟南芥野生型、GFP-α-tubulin-6转基因拟南芥及微管结合蛋白MAP18相关突变体为材料,利用药理学试验及激光扫描共聚焦显微技术研究了在脱落酸(ABA)诱导叶片气孔关闭过程中保卫细胞微管骨架的动态变化、根生长情况及其可能的调控因子。结果表明,微管结合蛋白MAP18过表达拟南芥OE的叶片气孔关闭现象敏感,MAP18 RNAi沉默株R18现象相对不敏感。外源ABA抑制拟南芥幼苗初生根的生长试验中,突变体OE根伸长减慢的现象显著,伸长速率由0.60 cm/d降低至0.12 cm/d,未处理时WT、map18的伸长速率都要低于OE的伸长速率,而用5μmol/L ABA处理之后,WT、map18的伸长速率高于OE的伸长速率。在此基础上研究了参与其中的作用因子,推测MAP18通过影响微管的动态重组参与到ABA诱导拟南芥气孔关闭和根伸长的生理过程。     

粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因转化拟南芥的表型研究

[目的]将过量表达典型粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因(LpTTG1)的转基因拟南芥株系表型与野生型和突变体进行比较,为深入研究LpTTG1基因的功能提供参考依据。[方法]在体视显微镜下,通过对拟南芥野生型、ttg1突变体及LpTTG1基因过表达转基因株系的植株表型,幼苗叶表皮毛、下胚轴和根毛以及种子形态进行观察比较。[结果]拟南芥ttg1突变体与野生型和LpTTG1过表达转基因型的幼苗在下胚轴的颜色、根毛着生方式、真叶表皮毛等方面有显著差异,但后两者表型间无显著差异。[结论]缺失TTG1基因可导致拟南芥幼苗形态发生显著变化,但此基因过量表达不一定对拟南芥形态产生影响。     

苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1的克隆及功能鉴定

【目的】异三聚体G蛋白(Heterotrimeric G protein)作为植物生物体内重要的信号转导分子,在感受外界环境刺激、参与植物抗逆反应和跨膜信号转导等方面发挥着重要作用。克隆异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1,并在烟草中过量表达MdGPA1,对其进行生物学功能鉴定和生理指标分析,为多年生木本植物响应环境因子信号转导过程中的分子机理研究提供参考。【方法】本研究以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为研究试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆获得MdGPA1。使用MEGA5.0构建GPA1物种间系统进化树;利用qRT-PCR方法检测该基因在苹果受非生物胁迫诱导表达及组织特异性表达情况。构建MdGPA1植物过表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶片,比较干旱胁迫条件下野生型和转基因株系的表型与生理指标,验证MdGPA1在植物干旱胁迫条件下的生物学功能。【结果】克隆得到苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1(基因序列号:MDP0000881842),该基因长为1 173 bp,编码390个氨基酸。进化树分析表明MdGPA1与白梨Pb GPA1亲缘关系最近,同源性最高。基因表达分析显示MdGPA1主要在叶片中表达,在根系中的表达量次之,在茎和果实中的表达量较低。定量分析表明,该基因参与干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫响应,在150 mmol·L~(-1)Na Cl、150 mmol·L~(-1)甘露醇、10%PEG和4℃胁迫条件下表达量明显下调,在5%H_2O_2胁迫处理下表达量明显上调。在烟草中过量表达MdGPA1,发现MdGPA1转基因烟草表现出对干旱敏感的表型特征,其叶片鲜重、叶绿素含量以及脯氨酸含量明显低于野生型烟草。在地下部,MdGPA1转基因烟草同样表现出对干旱敏感的表型特征;其根系形态相比于野生型较小,干重也明显低于野生型。【结论】MdGPA1参与了植物感受外界环境刺激的过程,对干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫都存在着不同程度的响应。在烟草中异源表达MdGPA1后,提高了烟草对干旱的敏感性,转基因烟草表现出不耐干旱的表型,受干旱胁迫比野生型烟草更为严重,说明MdGPA1在响应植物抗旱胁迫中起着负调控作用。     

A bifurcating pathway directs abscisic acid effects on stomatal closure and opening in Arabidopsis

Terrestrial plants lose water primarily through stomata, pores on the leaves. The hormone abscisic acid (ABA) decreases water loss by regulating opening and closing of stomata. Here, we show that phospholipase Dalpha1 (PLDalpha1) mediates the ABA effects on stomata through interaction with a protein phosphatase 2C (PP2C) and a heterotrimeric GTP-binding protein (G protein) in Arabidopsis. PLDalpha1-produced phosphatidic acid (PA) binds to the ABI1 PP2C to signal ABA-promoted stomatal closure, whereas PLDalpha1 and PA interact with the Galpha subunit of heterotrimeric G protein to mediate ABA inhibition of stomatal opening. The results reveal a bifurcating signaling pathway that regulates plant water loss.     

拟南芥TUA2参与ABA胁迫下的种子萌发过程

 【目的】利用反向遗传学研究拟南芥TUA2与ABA途径相关基因的相互关系以及对种子萌发的影响。【方法】采用PCR、Tail PCR和RT-PCR技术对来自ABRC的T-DNA插入TUA2突变体进行插入位点的鉴定和转录活性的分析;利用转基因技术获得TUA2超表达植株;检测了含不同浓度ABA的MS培养基中各突变体和TUA2超表达植株的种子萌发;通过RT-PCR检测了突变体中ABA途径相关基因HAB、ABI1、RD22和P5CS的表达变化。【结果】突变体tua2-1和tua2-2的T-DNA插入位点均位于TUA2的启动子区,且二者的TUA2表达量均升高。在含有ABA（0.8 μmol•L-1）的MS培养基中,突变体和转基因等5个株系的种子萌发延迟,播种第5天萌发率在6%—18%,相同条件下的野生型种子萌发率为76%;ABI1和HAB在TUA2超表达体中的表达明显低于野生型,受ABA诱导后被诱导表达的程度也远低于野生型。【结论】TUA2可能参与了ABA信号途径对种子萌发过程的调节。     

绿豆幼苗UV-B敏感性与环丁烷嘧啶二聚体累积的关系

【目的】明确绿豆品种间UV-B敏感性的差异与环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）累积间的关系。【方法】采用单克隆抗体ELISA法，研究0.4 W·m-2UV-B对两绿豆品种中绿-1和秦豆-20（Phaseolus raditus L. cv. Zhonglü-1 and Qindou-20）幼苗叶片DNA链内环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）的诱导形成及其光、暗修复，并对CPDs累积与绿豆UV-B敏感性的关系进行分析。【结果】两品种绿豆幼苗经UV-B处理4 d后，中绿-1叶片的生物量和净光合速率被抑制的程度明显低于秦豆-20，说明中绿-1对UV-B的敏感性低于秦豆-20。相应中绿-1叶片DNA中CPDs累积量和其形成能力也都低于秦豆-20，光修复能力明显高于秦豆-20，而两品种CPDs的暗修复能力基本相同，且均显著低于光修复能力。【结论】两品种幼苗CPDs形成能力和光修复能力的不同造成了两品种幼苗叶片在可见光下CPDs累积量的不同，进而可能导致了绿豆品种间UV-B敏感性的不同。另外，两品种CPDs形成能力的差异与紫外吸收物质含量有关。     

拟南芥PMRP基因在叶绿体淀粉粒积累和抗寒性中的作用

【目的】分析推测的膜蛋白(putative membrane related protein,PMRP)在拟南芥叶绿体发育过程的作用,明确PMRP对拟南芥光合能力的影响及抗寒性分析,为改善作物光合性能及增强抗逆性提供理论依据。【方法】构建PMRP的RNAi和过表达载体,转化农杆菌EHA105,采用花絮侵染法转化野生型拟南芥(Columbia,Col-0),获得PMRP RNAi和过表达转基因拟南芥;以野生型和PMRP RNAi、过表达转基因拟南芥为材料,利用细胞生物学方法,观察PMRP表达量对拟南芥叶肉细胞叶绿体的结构和淀粉粒积累的影响;利用红外CO2分析法测定拟南芥的光合速率,分析PMRP对拟南芥光合能力的影响。选取16 h光照、21℃条件下培养的21 d的野生型Col-0、3个过表达PMRP转基因拟南芥株系,3个PMRP-RNAi转基因拟南芥株系,用冷光源培养箱培养,先在4℃培养7 d,然后在-8℃培养1.5 h,取出放到16 h光照、21℃条件培养7 d后,分析PMRP转基因拟南芥对寒害的抗性。选取14 d的野生型Col-0、3个过表达PMRP转基因拟南芥株系和3个PMRP-RNAi转基因拟南芥株系,对其莲座叶细胞渗出液电导率进行测定。【结果】获得PMRP RNAi和过表达转基因拟南芥株系;通过测定野生型和转基因株系的莲座叶光合速率,野生型Col-0的光合速率为7.3μmol·m-2·s-1,PMRP-RNAi转基因拟南芥的光合速率分别为8.8、7.8和8.5μmol·m-2·s-1,PMRP表达量的降低略增强了拟南芥的光合速率。野生型Col-0的绿叶率为48%,过表达PMRP转基因拟南芥的3个株系绿叶率分别为48.6%、47.8%和49.2%,3个PMRP-RNAi转基因拟南芥的绿叶率分别为65.9%、67.4%和68.3%,表明PMRP表达量的降低增强了植物的耐寒性。在-8℃下处理30 min,野生型Col-0拟南芥莲座叶的渗出液电导率为70.67μS·cm-1,PMRP-RNAi拟南芥莲座叶渗出液电导率分别为48.57、45.40和52.10μS·cm-1。表明PMRP表达量的降低明显降低了逆境对细胞膜的损伤。通过对PMRP-RNAi转基因拟南芥和野生型拟南芥完全展开的莲座叶,进行超微结构分析,发现野生型拟南芥莲座叶细胞中,叶绿体为椭圆形,而PMRP-RNAi转基因拟南芥莲座叶细胞叶绿体变为近似圆形;在光照情况下,PMRP-RNAi转基因拟南芥叶绿体中淀粉粒的积累与野生型相似,均有明显的淀粉粒积累,但在黑暗环境中,PMRP-RNAi转基因拟南芥叶绿体中淀粉粒积累明显增多。【结论】PMRP表达量降低造成叶绿体形状由梭型变为圆球型,淀粉粒明显增多,增强了拟南芥的抗寒性。     

玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的克隆与基因表达分析

【目的】克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Gα亚基(Heterotrimeric Gproteinalpha subunit)基因及其启动子,并对其进行异源表达,为深入研究Gα基因的表达规律、基因功能和编码蛋白的特性奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得Gα基因的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。同时,利用pET原核表达系统获得基因的编码产物。【结果】获得1个玉米大斑病菌Gα基因—Stga-2的全长序列及其上游部分启动子区,并利用pET原核表达系统对Stga-2成功进行了异源表达。生物信息学分析表明,Stga-2全长1318bp,由4个内含子和5个外显子组成,编码产物包含356个氨基酸残基。在347bp的上游侧翼序列中未发现典型的TATA-box及CAAT-box,但在起始密码子上游30bp处发现了转录起始子特征序列及位于其上游能够起始真菌基因转录的C+T丰富区域,同时还有转录因子Sp1的识别位点、CCA基序(CCAmotif)及CCG重复基序(CCG repeats)等顺式作用元件。【结论】玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的成功克隆与表达进一步丰富了植物病原真菌的生物信息学资源,为深入了解植物病原真菌信号转导途径奠定了基础。