邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的制备及免疫鉴定

【目的】制备并鉴定1种新型邻苯二甲酸二丁酯人工抗原。【方法】以4-硝基邻苯二甲酸为原料,经过酯化、还原生成4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP),DBAP再与戊二酸酐反应,衍生生成4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)。将合成的半抗原衍生物DBCP通过活性酯法与牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联,得到人工抗原。通过免疫新西兰大白兔获得抗血清,经间接竞争酶联免疫法(ic ELISA)检测抗体特异性。【结果】经质谱、氢核磁共振谱图鉴定,半抗原衍生物合成成功,经紫外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫试验证实偶联成功,并计算得出DBCP与载体蛋白BSA和OVA的结合比分别为11∶1和17∶1。经ic ELISA法检测,兔1和兔2的血清效价均达到1∶128 000,IC50分别为301和308 ng·m L-1,反应特异性较好。【结论】半抗原衍生物的合成是方便、安全的。邻苯二甲酸人工抗原的成功制备使获得DBP多克隆抗体以及建立DBP免疫分析方法成为可能。     

溴氰菊酯人工抗原合成及鉴定

 以二溴菊酸和3-[(4-硝基苯)氧基]苯甲醛为原料经4步反应合成了溴氰菊酯半抗原1-氰基[3-(4-氨基苯)苯基]甲基-2,2-二甲基3-(2,2-二溴乙烯基)环丙烷羧酸酯;用重氮化法将溴氰菊酯半抗原分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）相偶联制备免疫抗原和包被抗原,紫外吸收法估算偶联比分别为11:1和8:1;以BSA偶联物作免疫抗原免疫日本大耳白兔制备溴氰菊酯多克隆抗体,间接非竞争ELISA法测定2个抗血清效价分别为100000和80000,间接竞争ELISA法初步测定农药浓度50μg/ml时抑制率达到80%以上,为研究建立溴氰菊酯农残免疫快速测定方法奠定了基础。     

高亲和力的农药克百威单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备高亲和力农药克百威单克隆抗体，建立克百威残留免疫检测方法，控制克百威残留，保障人民身体健康与保护环境。【方法】合成克百威半抗原BFNB，用人工抗原BFNB－BSA免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合，经间接ELISA筛选及显微克隆法亚克隆，分离出阳性细胞株，腹水诱导法及辛酸－硫酸铵沉淀法大量制备及纯化单克隆抗体，间接ELISA法测定抗体滴度及亲和力，间接竞争ELISA法测定抗体特异性。【结果】获得1株稳定分泌抗克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D3，其培养上清和腹水抗体滴度分别为1﹕2.048×103和1﹕1.024×106，其抗体亚类为IgG1，亲和力常数为2.54×109 L•mol-1，IC50为1.18 ng•ml-1，最低检测限为0.01 ng•ml-1。与克百威降解产物呋喃酚的交叉反应率为4.59×10-4％，另外几种结构类似的氨基甲酸酯类农药的交叉反应率均小于3.0×10-4％。【结论】此抗克百威的单克隆抗体亲合力高、特异性强，为建立克百威简便、快速、特异的免疫检测方法奠定了基础。     

取代脲类除草剂降解菌鞘氨醇杆菌(Sphingobium sp.)Pu21的分离和鉴定与降解特性

[目的]分离取代脲类除草剂的高效降解菌,为农药污染土壤的生物修复提供理论依据和物质基础。[方法]从农药厂废水处理池的活性污泥中分离筛选到1株取代脲类除草剂的高效降解菌株,结合形态、生理生化特征和16S rRNA基因序列对其进行鉴定,并研究其降解特性和降解途径。[结果]经鉴定,菌株Pu21为鞘氨醇杆菌(Sphingobium sp.),该菌能同时降解N,N-二甲基取代脲类除草剂异丙隆和N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂利谷隆。外界温度在25~35℃时对异丙隆和利谷隆降解影响较小,降解2种除草剂的最适温度均为35℃。在初始p H值为6.0~8.0时皆能快速降解异丙隆和利谷隆,最适p H值均为7.0。外加葡萄糖或麦芽糖时,对异丙隆的降解没有影响,但能提高利谷隆的降解,加入蛋白胨或酵母粉后2种除草剂的降解效率都显著提高。降解谱试验表明,菌株Pu21还可以降解敌草隆、伏草隆、绿麦隆、甲氧隆、灭草隆、非草隆和绿谷隆。依据HPLC和MS/MS结果,推测Pu21降解异丙隆途径为:异丙隆脲基侧链N-上脱甲基生成1-(4-异丙基苯基)-3-甲基脲(MDIPU),接着脱甲基生成1-对异丙基苯基脲(DDIPU),断开脲桥形成对异丙基苯胺(4IA)。利谷隆降解途径为:利谷隆脲桥直接断裂生成3.4-二氯苯胺(3,4-DCA)。[结论]菌株Pu21具有优良的降解能力,且降解底物谱广,在取代脲污染土壤的生物修复或生产废水生物强化处理中应用前景广阔。     

苦参碱人工抗原的合成与鉴定

【目的】合成并鉴定苦参碱人工抗原,以获取具有特异性和高亲和性的苦参碱多克隆抗体,为建立苦参碱的酶联免疫分析方法奠定基础。【方法】通过对槐果碱不饱和双键进行亲核加成、叠氮化、催化氢化合成苦参碱半抗原13氨基苦参碱(ST),并经MS、NMR法对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原与载体蛋白偶联合成苦参碱的人工抗原(ST-BSA和ST-OVA),经紫外光谱扫描法、SDS-PAGE法、红外光谱扫描法对人工抗原进行鉴定;将制备的苦参碱人工抗原免疫健康新西兰大白兔获得苦参碱的多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA方法测定其效价。【结果】成功合成了一种苦参碱半抗原13-氨基苦参碱(ST),与载体蛋白BSA、OVA偶联后得到了免疫原(ST-BSA)和包被原(ST-OVA),免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,效价达到128 000。【结论】成功合成了苦参碱人工抗原,为苦参碱免疫分析方法的研究提供了条件。     

鸡肉中氟苯尼考ELISA检测方法的建立及应用

 【目的】制备抗氟苯尼考（FFC）的高亲和力特异性抗体,建立检测氟苯尼考的间接竞争ELISA新方法。【方法】氟苯尼考分别与牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）经混合酸酐法偶联,得到免疫抗原和包被抗原,其偶联比分别为14.4和14.7。用免疫原FFC-HS-BSA免疫新西兰大白兔获得了效价较高的特异性抗体。建立并优化了间接竞争ELISA检测方法。【结果】抗血清效价为1﹕102 400。最佳包被抗原浓度为0.5 μg?ml-1,最佳抗体工作浓度为1﹕6 400,酶标二抗的工作浓度为1﹕20 000。回归方程Y = -0.1516X + 0.788（R2 = 0.9859）,检测范围为0.18～500 ng?ml-1,检出限为0.18 ng?ml-1,批内和批间平均变异系数分别为4.86%和7.77%。交叉反应试验中,抗血清与FFC结构相似的氯霉素和甲砜霉素交叉反应率分别为0.094%和0.098%,与其它药物交叉反应率均小于0.01%,表明该方法具有很强的特异性。FFC以浓度0.18～500 ng?g-1在鸡肉中添加,回收率为84.14%～106.1%,变异系数为2.1%～5.6%。【结论】成功获得了高效价、高特异性的抗FFC抗体,建立了鸡肉中氟苯尼考残留检测的ELISA方法。结果表明,所建立的检测方法具有灵敏、准确、简便、快速的特点。     

硫代磷酸酯类农药通用抗原的合成与鉴定

【目的】合成具有硫代磷酸酯类农药共性结构的系列半抗原,制备此类农药的通用人工抗原。【方法】以烷氧基硫代磷酸盐和卤代羧酸为原料合成半抗原,采用¹HNMR、¹³CNMR及EIS-MS谱图对其结构进行表征。将合成的半抗原分别通过活性酯法、混合酸酐法与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联,制备免疫人工抗原和包被人工抗原。用紫外扫描法定性分析人工抗原的偶联情况,用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）法间接测定其偶联比。【结果】合成了H1～H6 6种具有硫代磷酸酯类农药共性结构的半抗原,其中H1、H2为包被半抗原,H3～H6为免疫半抗原。制备了H1-OVA、H2-OVA、H3-BSA、H4-BSA、H5-BSA、H6-BSA、H2-BSA、H4-OVA和H6-OVA 9种人工抗原,其偶联比分别为9∶1、10∶1、23∶1、26∶1、39∶1、43∶1、28∶1、14∶1和12∶1。【结论】成功合成硫代磷酸酯类农药的人工抗原,为下一步用其免疫动物制备抗体进而进行有机磷农药酶联免疫分析奠定了基础。     

氯羟吡啶人工抗原的合成及抗体特性

研究氯羟吡啶(CLOP)人工抗原合成及其多克隆抗体(pAb)制备。将CLOP进行化学修饰引入活性基团羧基,合成氯羟吡啶半抗原(CLOP-2C);分别采用活泼酯法和混合酸酐法将CLOP-2C与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫原CLOP-2C-BSA和包被抗原CLOP-2C-OVA,用紫外(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;用CLOP-2C-BSA免疫Balb/c小鼠,间接ELISA测定CLOP pAb效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明:CLOP-2C-BSA偶联成功,CLOP-2C与BSA的分子结合比为34.0∶1;CLOP pAb效价达到1∶(2.56×104),对CLOP的IC50为7.76μg/L,与其他抗球虫药的交叉反应率低,获得高价、敏感、特异的CLOP pAb,为CLOP残留免疫学检测方法的建立奠定基础。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br#

 【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng•mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng•mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng.mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng.mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

Development of Anti-Isoproturon Polyclonal Antibody

A competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) suitable for the determination of the urea herbicide isoproturon,3-(4-isopropylphenyl)-1,1-dimethylurea, in food and environmental samples was developed. Two haptens named 1-(3-carboxypropyl)-3-(4-isopropylphenyl)-1-methylurca (hapten 4C) and 1-(5-carboxypentyl)-3-(4-isopropylphenyl)-1-methylurea (hapten 6C) were synthesized. The haptens were coupled to bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin(OVA), respectively, using the N-hydroxysuccinimide reaction. The hapten 6C-BSA conjugate was used as the immunogen,with which a high-titer anti-isoproturon polyclonal antibody (pAb) was successfully obtained by immunization of New Zealand white rabbits. The hapten 4C-OVA conjugate was used as coating antigen and a method of the indirect competitive ELISA for isoproturon was established. The haptens were confirmed with TLC, IR, and 1H NMR. The conjugation molar ratios of hapten 4C to OVA and hapten 6C to BSA were 36:1 and 46:1, respectively, as calculated by a UV spectrophotometry.The highest titer of the anti-isoproturon sera determined by a non-competitive indirect ELISA procedure was 1.6×105. The optimal concentrations of the coating antigen and the dilution of the anti-isoproturon sera used in the ELISA were 0.1 mg L-1 and 1.0 × 105, respectively. The concentration of isoproturon that inhibits 50% of antibody-antigen binding (IC50) was 0.07 mg mL-1.The cross-reactivities of six urea herbicides including chlorbromuron, fluometuron, monolinuron were lower than 0.1%. Isoproturon is a small molecule without immune activity and active functional group for attaching to carrier protein. To produce an antibody against isoproturon with high titer and high specificity is the most important step in the development of an immunochemical method for the determination of isoproturon in food and environmental samples. The two haptens synthesized in this study have carboxyl groups and accommodate different lengths of spacer arms, and the phenyl and isopropyl groups are fully exposed. An anti-isoproturon polyclonal antibody with high titer and high specificity was successfully obtained by immunization of rabbits with the conjugate of the hapten attached to the protein carrier.     

Gompertz增长模型在林产品产值预测中的应用

应用增长模型的理论和方法，根据《临安五十年》中的统计数据建立Go mpertz增长模型γ=6exp[-5.8020e^-0.3679t]，并对临安市的林产品的产值进行预测。预测结果与实际值的相对误差仅为00082%相关指数达到0.9992，表明模型与实际值拟合程度很好，达到了较高的精度，预测方法简便易行，具有实用意义。模型也可用来预测经济林产量和资源消耗量等，为林业生产、经营及技术更新提供决策依据，提高管理上的宏观调控能力。图3表1参4。     

宜兴百合脱毒技术

1997～2000年以宜兴百合为试材，对3种脱毒方法(茎尖培养、热处理结合茎尖培养、花药培养)进行研究。结果表明，珠芽经(50±1)℃热水处理40min，培养30d后，切取0.8～1.0mm茎尖培养的脱毒效果最好，脱毒率达100%；(38±1)℃热空气处理后切取茎尖培养也能提高脱毒效果。只有通过病毒鉴定的试管苗，方能用于生产。     

不同年龄毛竹笋用林竹鞭根系吸收能力

毛竹笋用林地下鞭根系统的吸收能力是影响竹笋产量的关键因素之一。为充分认识毛鞭根系吸收能力的变化规律，达到增产增收的目的。对浙江省内较为典型的3种毛竹笋用林实施根系取样，并采用吸附甲烯蓝法进行根系吸收能力的测定。结果表明：2－4年生毛竹根的吸收能力最强，随着年龄的增加逐渐转弱。2年生竹鞭根吸收能力较弱，尚处于生长发育阶段；3－4年生鞭根根系最强壮吸收能力最强，5－6年生竹鞭开始老化，根系吸收能力下降。表3参3     

乙醇／己烷混合溶剂一次性浸提油茶枯饼

对95%乙醇和已烷构成的混合溶剂的特性、茶油对混合溶剂的混溶优质及混合溶剂对油茶枯饼的浸出工艺进行了研究。结果表明：95%乙醇和已烷的体积比在7：30-4：6范围内，两者均可混溶，茶油对混合溶剂的混溶温度有提高的趋势，混合溶剂对茶油的最大溶解度在14.0%左右，当95%乙醇和已烷的体积比为5：5，浸出温度为58℃，料液比为2：1，浸出时间为5h时，对残油和油茶皂素的提取较合适；残油和油茶皂素的得率分别为3.6%和7.0%,表6参7。     

Catalytic reduction of dinitrogen to ammonia at a single molybdenum center

Dinitrogen (N2) was reduced to ammonia at room temperature and 1 atmosphere with molybdenum catalysts that contain tetradentate [HIPTN3N]3- triamidoamine ligands (such as [HIPTN3N]Mo(N2), where [HIPTN3N]3- is [(3,5-(2,4,6-i-Pr3C6H2)2C6H3NCH2CH2)3N]3-) in heptane. Slow addition of the proton source [(2,6-lutidinium)(BAr'4), where Ar' is 3,5-(CF3)2C6H3]and reductant (decamethyl chromocene) was critical for achieving high efficiency ( approximately 66% in four turnovers). Numerous x-ray studies, along with isolation and characterization of six proposed intermediates in the catalytic reaction under noncatalytic conditions, suggest that N2 was reduced at a sterically protected, single molybdenum center that cycled from Mo(III) through Mo(VI) states.     

鸡MHCⅡ类分子部分基因的原核表达及单克隆抗体的制备与鉴定

[目的]制备鸡MHCⅡ类分子的单克隆抗体。[方法]在分析鸡MHCII类分子蛋白序列基础上,选取鸡MHCⅡα链基因第2～6外显子和β链基因第3～6外显子进行原核表达,以纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆和间接ELISA筛选阳性细胞株。[结果]共得到1株分泌鸡MHCⅡα链抗体和2株MHCⅡβ链抗体的杂交瘤细胞,分别命名为MHCⅡα-4、Ⅱβ6-2和Ⅱβ6-31,其腹水效价分别为1∶256000、1∶256000和1∶1280000。Western blotting分析表明其特异性强,能与相应蛋白结合。[结论]成功获得了3株稳定分泌抗鸡MHCⅡ类分子抗体的杂交瘤细胞。     

外源木炭对异丙隆在土壤中吸附-解吸的影响

 【目的】研究除草剂异丙隆在木炭上的吸附-解吸规律,探讨外源木炭对减少异丙隆从土壤中流失的作用机制,为土壤-水环境中农药的污染防治提供依据。【方法】采用振荡平衡法,研究了异丙隆在5个不同粒径木炭和3种不同类型土壤中的吸附-解吸特征。【结果】异丙隆在木炭和土壤中的吸附-解吸均符合Freundlich方程。木炭对异丙隆有很强的吸附能力,木炭粒径越小,对异丙隆的吸附能力越强。添加木炭能够显著提高土壤对异丙隆的吸附量,木炭添加量越多,异丙隆吸附量越大,木炭添加量与异丙隆吸附量呈显著正相关（相关系数r=0.9568**）。异丙隆在木炭和土壤中的解吸过程均存在明显的滞后效应,且这种滞后效应随着木炭添加量的增大而逐渐加强。环境扫描电镜（ESEM）分析显示,木炭具有疏松多孔结构,对异丙隆具有较强的物理吸附能力。红外光谱（FTIR）分析结果表明,异丙隆可能通过氢键或范德华力与木炭结合。【结论】以木炭作为人工添加吸附剂可有效地减少异丙隆从土壤中的流失。     

转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅱ.Bt杀虫晶体蛋白抗体的制备

用碳酸钠裂解液(50mmol/LNa2CO3,50mmol/LEDTA,pH10)从BacillusthuringiensisHD-1的孢晶混合物中分离提取杀虫蛋白的基础上,进一步用聚丙烯酰胺凝胶制备电泳技术纯化杀虫蛋白,获得了高纯度的杀虫蛋白作为抗原,用于免疫家兔制备抗体。比较了不同抗原注射剂量的免疫效应和免疫过程中(不同注射时间)抗体生成量的变化。结果表明,供试的二种抗原注射剂量对抗体的效价无明显影响,随着免疫次数的增加抗体效价不断上升,最终获得了用琼脂双扩散测定效价为1/120的抗血清。Bt杀虫蛋白的免疫原性低。抗血清中的抗体免疫球蛋白(Ig),首先经硫酸铵分级沉淀粗提,再用DEAE-52纤维素柱层析提取纯化,获得了高纯度的IgG,为抗体的酶标记和ELISA检测杀虫蛋白等研究提供了高特异性的Bt抗体。研究的结果为Bt菌HD-1杀虫蛋白抗体的制备提供了依据。     

鸡腿蘑液体菌种生产及栽培试验研究

用深层发酵法进行鸡腿蘑液体菌种的生产，从5个鸡腿蘑品种中，确定了一株适于深层发酵的菌株一瑞10，该菌株较适宜的液体培养基组分为：4%玉米粉，2%蔗糖，2%麸皮，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4.7H2O，适宜的摇瓶条件为：培养基的起始pH值为7，250mL摇瓶装液量为40mL，接种量为10%，培养温度25℃.15L发酵罐控制参数为：装料系数0.7，接种量10%，通气量：1：0.5-1.2，搅拌速度为120-180r.min^-1，用液体菌种进行鸡腿蘑栽培试验结果显示，深层发酵法生产鸡腿蘑比传统栽培方式生产周期可缩短60d，抗杂性能优于传统生产方式，出菇性能与传统生产式无显著差异。