水稻OsCERK2转基因后代的鉴定与分析

为了研究水稻Os CERK2基因的功能,构建了Os CERK2基因过表达和RNAi载体,利用农杆菌介导的遗传转化获得转基因植株,经多代筛选和分子检测,获得了4个超量表达的过表达纯系和2个转录水平下降的RNAi纯系。转基因植株经病原微生物细胞壁成分喷雾处理,采用半定量RT-PCR方法分析转基因植株中病程相关(PR)基因的表达情况,结果发现,诱导后过表达植株中PR基因表达增强,而RNAi植株中表达下降;抗病性鉴定结果表明,过表达转基因植株对白叶枯菌致病小种PXO99的抗性增强,而RNAi植株与野生型差异不显著。结果表明,过量表达Os CERK2基因可能是水稻抗病的有效途径。     

水稻高效RNA干涉体系的建立及其在受体激酶基因功能研究中的应用

利用RNA干涉(RNAi)技术，可以特异性的抑制真核生物体中目标基因的表达。本研究构建了适合水稻转化的RNAi诱导载体pCADS1341。为检测其有效性，使用它构建了针对GUS基因的RNAi载体，并利用基因枪转化法导入GUS基因稳定表达的转基因水稻愈伤组织。GUS染色分析结果表明该载体中RNAi诱导元件的瞬时表达可显著抑制GUS基因的表达。为探讨影响水稻中转基因诱导的RNAi效率的因素，对针对某个目标水稻基因的水稻RNAi植株进行了详细的分析。通过Southern和Northern杂交检测了T0代RNAi植株中T-DNA插入的拷贝数和目标基因的表达量，筛选出T-DNA为单拷贝插入，且目标基因的表达被高效抑制的株系。对来源于该株系的T1代植株进行了半定量RT-PCR检测，结果表明RNAi效应可以遗传给后代转基因水稻植株，但是不同个体中的RNAi效率存在差异。RNAi系统的表达量可能是决定RNAi效率的最关键因素。我们建立的高效RNAi技术体系对于水稻功能基因组学研究具有重要意义，利用这个系统我们已经构建了60多个水稻受体激酶基因的RNAi载体，系统的研究正在进行中。     

水稻锌指蛋白基因OsZRL过表达对根系发育的影响

锌指蛋白是目前研究最为深入的一类转录因子,在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究克隆了水稻的一个锌指蛋白转录因子基因(OsZRL),并构建OsZRL基因过量表达载体,通过农杆菌介导法转入野生型水稻品种日本晴,获得转基因阳性分化植株。其中一些转基因小苗因根系不能正常发育而死亡,经定量分析这些转基因株系中OsZRL基因表达量显著高于野生型,初步表明锌指蛋白基因OsZRL与水稻根系发育有关。     

水稻PFP基因的克隆及其遗传转化

采用RT–PCR方法,成功克隆到1个与水稻苗期耐热相关的基因PFP,构建了该基因的超表达载体,通过基因枪法转化水稻品种中花17,获得9个转基因阳性植株,与对照相比,T1代转基因植株的苗期耐热性明显增强。33个代表性地方水稻品种的耐热表型与PFP基因型的相关性分析结果表明,PFP基因的基因型与品种的耐热表型存在显著的相关性。本研究中还分析了该基因在盐、4℃低温、PEG和ABA胁迫处理下的基因表达情况。     

OsGA20ox2基因过量表达对水稻性状的影响

为研究水稻赤霉素20-氧化酶2(OsGA20ox2)基因的过量表达对水稻株高和生长发育的影响,通过RT-PCR扩增OsGA20ox2基因并构建该基因的过量表达载体pS12Q,采用农杆菌介导法遗传转化水稻,获得了高秆转基因植株.获得T0代的85株中,对其叶片基因组DNA进行Hyg基因扩增,发现其中2株为转基因植株且表现为高秆.分析其T2代表型,高秆植株与对照相比,株高增加9.41％ (P＜0.05);穗颈长增加15.62％ (P＜0.05);倒1节间长度增加8.46％(P＜0.05);穗长增加7.98％(P＜0.05);穗粒数增加6.8％(P＜0.05);分蘖数增加了12.5％ (P＜0.05);百粒重增加2.6％(P＜0.05);开花提前10天.这些性状导致高秆植株的产量增加,生育周期缩短.RT-PCR结果显示OsGA20ox2基因在高秆植株茎中的表达高于对照,促进了水稻茎的延伸.结果表明OsGA20ox2基因的过量表达影响了水稻的株高和生长发育.     

乙烯应答因子W17基因RNAi表达载体的构建及小麦遗传转化

干旱、高盐和病虫害严重影响了作物的产量和品质.ERF(ethylene responsive factor)转录因子是介导生物和非生物胁迫响应的重要调控因子.本实验室从小麦中克隆到抗逆相关ERF转录因子W17基因,本研究以植物表达载体pAHC25为基础,构建了含有反向重复序列的RNAi表达载体pAHC-W17RNAi.采用基因枪法45枪轰击小麦品种新春9号幼胚材料2 379个,共获得115株T0代再生植株,其中12株为阳性转基因植株.半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中W17基因及其调控的下游基因的表达水平均显著下降;表型鉴定发现转基因小麦苗期发育受到抑制.本研究为深入分析小麦ERF基因的功能与作用机制,进而通过分子育种进行小麦抗性改良奠定了基础.     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

大豆促苗期根系发育相关基因Gmr937在烟草中的功能分析

将构建好的植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmr937和RNAi表达载体pCAMBIA3301-RNAi-Gmr937,通过农杆菌介导的叶盘法将植物表达载体转入烟草。经PCR检测得到T1代过表达载体阳性植株13株,RANi表达阳性植株11株。对阳性植株进行荧光定量PCR,测定目的基因的表达量,结果表明Gmr937基因在转化烟草根、叶片中表达量最高,是未转化植株12倍,在茎中表达量最低,是对照7倍;在转干扰表达载体植株苗期根、叶中表达量是对照0.7倍,在茎中的表达量是对照0.85倍。以CaMV35s启动子为探针进行Southern杂交检测,结果表明转化的目标基因以单拷贝整合到受体烟草基因组中。测量适宜条件下培育的转基因烟草侧根总长度,结果表明超表达转基因植株的侧根平均总长度为117cm,比未转化烟草平均增加了8cm;RNAi干扰转基因植株侧根总长度平均为80cm,比对照组减少了11cm,说明Gmr937基因对烟草侧根的发育有促进作用。对干旱处理7d后的转基因烟草的抗旱生理生化指标进行测定,结果表明Gmr937基因在烟草中超表达提高了烟草植株的耐旱性。     

光敏色素B在调控水稻苗期株高和生物量中的作用

水稻光敏色素基因家族包括3个成员:PHYA、PHYB和PHYC。已有研究表明,phyB在调节水稻幼苗去黄化、叶角、花期以及非生物胁迫反应中具有重要作用,但是phyB对水稻苗期株高和生物量的影响仍未有报道。本研究比较了野生型和phyB突变体(phyB1和phyB2)在不同培养条件下苗期的株高、鲜重和干重,结果表明,在营养液和基质培养条件下,phyB突变体的株高均显著低于野生型,鲜重和干重与野生型差异并不明显,据此推测,phyB调控水稻苗期株高,但对生物量的影响不明显。利用基因芯片技术,比较了野生型和phyB突变体苗期地上部分的基因表达图谱,筛选到受phyB上调的基因115个,受phyB下调的基因95个;差异基因的GO富集分析结果表明,富集的基因主要参与水稻生长等生物学功能,因此推测通过调控这类基因的表达而影响苗期生长。本研究首次揭示了phyB对水稻苗期株高和生物量的影响,并进一步讨论了phyB在选育机插秧水稻品种中的潜在应用价值。     

转基因水稻外源基因的遗传和表达初步研究

将天蚕抗菌肽B基因应用基因枪法导入水稻TN1发芽肿胚，获得转基因植株2株，转基因水稻T1－T5 5个世代不同株系，对bar基因、抗菌肽基因的遗传和表达进行初步研究。结果表明：转基因后代株系bar^R:bar^S在部分符合3：1分离比率。T1、T4转基因株系PCR、Southern印迹分析表明，T18株有抗菌肽B基因；T4仍有4个株系有抗菌肽基因，其他的株系基因丢失，T3 1个株系Northern印迹证明抗菌肽基因在RNA水平有表达；抗菌肽B转基因水委对白叶枯病的抗病性有提高，抗性能传递到高世代，在T3得到抗病性提高的株系。     

水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的克隆及表达分析

利用5′-RACE方法克隆了在水稻与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)互作过程中下调表达的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的全长序列。通过生物信息学方法分析了该基因及编码蛋白质的结构特征,OsCtBP-A由424氨基酸组成,N端具有2-Hacid_dh_C保守结构域,C端具有植物CtBPs家族特有的NLS和PEST基序,氨基酸序列与拟南芥和牵牛花CtBPs同源物的同源性为63%;基因启动子区推测具有ABA和SA应答调控元件。OsCtBP-A基因对不同信号分子应答的RTQ-PCR分析表明,水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ETH)和脱落酸(ABA)处理水稻后均能诱导该基因的转录表达,但诱导能力有所差异,其中ABA诱导活性最强。     

OsVIP1 RNAi转基因水稻植株的构建

为进一步阐明农杆菌介导的遗传转化分子机制,进而利用分子生物学方法提高农杆菌转化水稻效率,以水稻品种中花11为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白进行了功能研究。通过同源性比对得到水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白序列,命名为OsVIP1,构建了该蛋白基因2个片段(R1和R2)的RNAi表达载体pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2,通过农杆菌介导的方法分别转化水稻中花11。对转基因抗性愈伤进行统计,结果表明,由携带pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2载体转化的抗性愈伤的形成受到一定程度抑制。经PCR检测,证明2个片段R1和R2均成功整合到再生水稻植株基因组中;半定量RT-PCR分析显示部分RNAi转基因植株中OsVIP1基因表达被成功抑制。     

BWMK1互作基因BWIP4对粳稻的转化

通过酵母双杂交体系,获得了7个BWMK1互作基因BWIP1~BWIP7.从中选取BWIP4作进一步的功能分析,构建了BWIP4-RNAi表达载体pANDA-BWIP4和超表达载体NCGR-1300-BWIP4,利用农杆菌介导法转化粳稻日本晴,获得了35个干涉株系和136个超表达转基因株系,对经PCR、GUS检测的阳性植株进一步进行RT-PCR检测,干涉株系中BWIP4的表达量低于日本晴,而超表达株系中BWIP4的表达量高于日本晴.     

水稻osvdac基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

[目的]构建水稻osvdac3和osvdac5基因RNA干涉表达载体,获得转干涉载体的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到osvdac3和osvdac5的分别靠近5’端和3’端约500～600bp的特异序列,用Gateway重组克隆技术构建RNA干涉表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]成功构建水稻2个osvdac3和2个os-vdac5基因RNA干涉表达载体,并获得转osvdac3干涉载体的阳性植株。[结论]干涉osvdac3和osvdac5的植株为研究其功能提供材料。     

水稻OsCERK2转基因植株的获得及初步分析

以水稻粳稻品种日本晴为研究材料,利用拟南芥CERK1的蛋白质序列检索,在水稻基因组候选了与拟南芥CERK1同源的水稻基因OsCERK2,通过RT-PCR分离了该基因的全长cDNA。生物信息学分析显示,OsCERK2是一种含有信号肽的质膜蛋白,胞外结构域含有LsyM基序,激酶结构域含有酪氨酸蛋白激酶结构域。构建了由35S启动子驱动该基因的过表达遗传转化载体和由玉米的泛素基因的启动子驱动的RNA干涉（RNAi）的遗传转化载体,利用农杆菌介导的遗传转化技术,将OsCERK2基因导入水稻,得到T0代转基因植株。对T0代植株进行了PCR检测和半定量RT-PCR检测,获得了OsCERK2有效表达的转基因植株。     

RNAi-mediated transgenic rice resistance to Rice stripe virus

Rice stripe virus(RSV) often causes severe rice yield loss in temperate regions of East Asia. Although the correlation of small interfering RNAs(si RNAs) with transgenic virus resistance of plants using RNA interference(RNAi) is known for decades, no systematical research has been done on the profiling of si RNAs from a genomic scale. Our research is aiming to systematically study the RNAi impact in RSV-resistant transgenic rice, which was generated by introducing an inverted repeat construct that targets RSV nucleocapsid protein(NCP) gene. In this paper, three independent RSV-retsistant transgenic rice lines were generated, their stable integration of the T-DNA fragment and the expression of si RNAs were confirmed by Southern blotting and Northern blotting analyses, and the majority of si RNAs were in lengths of 21, 22, and 24 nucleotides(nt), which have validated a connection between the presence of the RSV NCP homologous si RNAs and the RSV resistance in those transgenic rice lines. In one of these transgenic lines(T4-B1), the T-DNA fragment was found to have been inserted at chromosome 1 of the rice genome, substituting the rice genome fragment from 32 158 773 to 32 158 787 nt. Bioinformatics analysis of small RNA-Seq data on the T4-B1 line also confirmed the large population of NCP-derived si RNAs in transgenic plants, and the RSV-infected library(T4-B1-V) possessed more si RNAs than its mock inoculated libraries(T4-B1-VF), these results indicating the inverted repeat construct and RSV could introduce abundance of si RNAs in transgenic rice. Moreover, a varied expression level of specific si RNAs was found among different segments of the NCP gene template, about 47% of NCP-derived si RNAs reads aligned with the fragment from 594 to 832 nt(239 nt in length) in NCP gene(969 nt in length) in the T4-B1-V, indicating a potential usage of hotspot regions for RNAi silencing in future research. In conclusion, as the first study to address the si RNA profile in RSV-resistant transgenic plant using next generation sequencing(NGS) technique, we confirmed that the massive abundance of si RNA derived from the inverted repeat of NCP is the major reason for RSV-resistance.     

RNA干涉水稻端粒酶再生植株的初步研究

依据水稻端粒酶基因的相关生物学信息,构建了含有水稻端粒酶序列RNA干扰结构的植物表达载体pC am 23A-1-2,并利用农杆菌介导法将目的基因导入到粳稻品种日本晴中,获得了78个独立转化子,共165棵转基因植株。通过PCR和Southern杂交分析,证明RNA干扰结构已整合进水稻基因组中;应用染色体末端限制性片段分析法,显示在转基因水稻中端粒DNA序列长度有逐代缩短的趋势,初步证明这些转基因水稻中端粒酶亚基已失活,但是T0和T1代转基因水稻植株的主要农艺性状没有发生明显变化。     

水稻基因OsAFC2参与mRNA可变剪切调控

mRNA的可变剪切受到SR蛋白磷酸化水平的精确调控,AFC2作为SR蛋白激酶,能够影响mRNA可变剪切。在水稻RNAi突变体库中发现一个Os AFC2基因沉默突变体,进一步研究显示该基因定位于细胞核内,在水稻的各个组织部位均有表达,其中在叶片中表达量较高,在茎中表达量较低。与对照相比,在Os AFC2抑制表达的植株中,检测到的可变剪切数量明显增加,表明Os AFC2参与水稻细胞核中mRNA可变剪切的调控。     

水稻蛋白激酶OsCIPK5的亚细胞定位分析及RNAi转基因水稻的获得

在植物生长发育中,CIPKs(CBL-interacting protein kinases)在胁迫信号转导和增强抗逆途径中发挥着重要作用,而OsCIPK5的具体功能还未知。为了研究OsCIPK5的功能,本研究从日本晴水稻中成功克隆了OsCIPK5基因。用生物信息学方法对其编码的蛋白进行分析,结果表明OsCIPK5含有2个功能区即激酶活性区和NAF区,OsCIPK5与5种植物的CIPK5同源性较高,而与短花药野生稻CIPK5的同源性最高(94%),亲缘关系最近。利用植物生理学方法对水稻进行低钾处理,结果表明水稻根中OsCIPK5受低钾诱导表达,而叶片中OsCIPK5表达量没有变化;同时构建了OsCIPK5与黄色荧光蛋白基因融合的植物瞬时表达载体,共聚焦显微镜观察显示,OsCIPK5编码的蛋白主要定位在细胞核、细胞膜,还以颗粒状结构不规则分布在细胞质中。进一步构建了OsCIPK5的RNAi载体,通过水稻遗传转化体系获得26株阳性转基因水稻。荧光定量PCR(Real-time qPCR)分析表明,T1代转基因水稻中OsCIPK5的表达量与野生型相比显著降低。OsCIPK5的生物信息学分析、植物生理学分析、亚细胞定位以及RNAi转基因水稻的获得为研究OsCIPK5的功能奠定了基础。