一种快速、高效的大豆农杆菌转化技术

【目的】拟通过改进大豆外植体的组织培养、农杆菌侵染以及植株再生等关键性环节,构建快速、高效的大豆转基因技术体系,解决外源基因难以导入大豆的难题。【方法】成熟大豆种子在环境温度25～28℃、含有1 mg•L-1 6-苄氨基嘌呤的MSB5培养基上催芽24 h。保留大豆下胚轴、胚尖及1片子叶作为外植体,并在相同条件下预培养24 h。将外植体转入2/3 MSB5液体培养基（1 mg•L-1 6-苄氨基嘌呤＋100 μmol•L-1乙酰丁香酮＋携带有Ti质粒pBI121的根瘤农杆菌GV3101）中,在28℃黑暗环境下侵染21 h。侵染后的外植体在28℃黑暗条件下共培养3 d。外植体经无菌水处理后移栽到灭菌土中,并在适宜条件下培养。【结果】分子检测结果表明,本研究涉及的新型外植体的再生率高达90%以上（中品661为95%,垦农18为93%,绿75为90%）,转化效率明显提高;而利用子叶节和胚尖进行培养获得的外植体的再生率仅50%和70%。此外,本研究涉及的大豆转化体系省去了外植体后期繁琐、耗时的组织培养步骤,再生周期明显缩短。【结论】与前人报道的大豆遗传转化体系技术相比,本研究所使用的方法更加快速、高效,可为农杆菌介导的大豆转基因、突变体构建等基因组学研究提供强有力的技术平台。     

向日葵(Helianthus annuus L.)不同外植体组织培养及其再生的研究

【目的】建立向日葵不同外植体离体培养再生体系，为向日葵遗传转化、突变体筛选奠定基础。【方法】以不同基因型向日葵为材料，研究了向日葵不同外植体在不同的培养基中诱导不定芽再生的频率。【结果】向日葵不同基因型外植体在含适宜吲哚-3-乙酸（IAA）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）等激素的培养基中均较易形成愈伤组织，但愈伤组织诱导不定芽的能力则较弱；不同基因型向日葵外植体的不定芽诱导率依次为子叶节＞下胚轴＞子叶＞真叶；诱导子叶节不定芽再生的适宜6-BA浓度为1.2～1.8 mg•L-1， 下胚轴为1.8 mg•L-1，子叶为0.6 mg•L-1，真叶却未见到诱导出不定芽；MS + 0.03 mg•L-1 IAA + 1.2～1.5 mg•L-1 6-BA培养基可用于向日葵子叶、子叶节和下胚轴再生体系；不同基因型向日葵诱导不定芽的能力差别较大，其中，基因型PR29再生能力较强。【结论】本研究成功地建立了向日葵不同外植体离体培养再生途径，并获得了再生植株。     

胸腺肽基因转化生菜及其表达的研究

 以4d苗龄的美国大速生生菜无菌苗子叶为外植体,通过根癌农杆菌介导, 将胸腺肽基因(thy)导入生菜。研究结果表明,含有卡那霉素75 mg·L-1的MS1-1培养基(MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1NAA+Cb500 mg·L-1) 为最适子叶外植体转化后诱导芽再生的培养基,经抗性筛选,将抗性芽切下于MS1-2培养基(1/2MS + Kan50mg·L-1+Cb100 mg·L-1)上诱导生根。通过PCR和Southern杂交分析证明,胸腺肽基因已经整合到生菜基因组中。RT-PCR     

农杆菌介导大豆子叶节转化系统的优化

 【目的】研究影响大豆（Glycine max L.）子叶节外植体遗传转化的因素。【方法】以农杆菌转化系统为平台,用直接筛选法和延迟筛选法确定卡那霉素的筛选方法和浓度,以GUS基因的瞬时表达计算子叶节区GUS阳性率。【结果】延迟7 d进行Km选择、筛选压力为75 mg•L-1时选择效果最好;菌株培养阶段和侵染浓度分别在OD600为0.6和0.5时子叶节区GUS阳性率最高;黑农35、绥农14和合丰35为易感的大豆基因型;农杆菌菌株EHA101对大豆的转化能力好于LBA4404和AGL1;共培养培养基中添加的硫醇类化合物对T-DNA的转移有极强的影响效应。【结论】本实验方法可以优化农杆菌介导的大豆子叶节转化系统。     

南林895杨离体培养及耐盐基因GmNHX1的转化

摘要：【目的】建立南林895杨杂交无性系最适遗传转化体系,为创新耐盐南林895杨种质资源奠定基础。【方法】以南林895杨叶片和茎段为外植体,对其再生体系和耐盐基因GmNHX1遗传转化的部分影响因子进行分析。【结果】使用NaClO消毒处理10～15min的外植体褐化率和污染率均较低;以叶片为外植体产生的不定芽状态良好,而茎段分化的不定芽容易白化死亡。PCR检测结果表明,转GmNHX1基因植株可扩增获得符合大小的特异性条带（1641bp）;通过荧光显微镜能够观察到转基因植株中的SGFP激发出的绿色荧光,证明GmNHX1基因已经高效整合到南林895杨的基因组中。【结论】叶片是南林895杨离体培养再生体系的最佳外植体来源,其离体培养所得的植株完全可以满足根癌农杆菌介导基因转化对受体的要求,可用于耐盐基因GmNHX1的遗传转化。     

根癌农杆菌介导观赏羽衣甘蓝遗传转化体系优化

为建立稳定的羽衣甘蓝遗传转化体系,以羽衣甘蓝自交系'Mark 10','W02-7'和'Curly 6'为试材,通过单因子试验,比较羽衣甘蓝子叶、子叶柄、子叶片、下胚轴4种外植体的再生能力,筛选培养基中的适宜激素浓度,优化了羽衣甘蓝不同外植体的再生体系。将播种后6d的子叶于最适再生培养基上进行黑暗预培养,以根瘤农杆菌为介导侵染子叶后,于黑暗条件下进行农杆菌与植物材料的共培养。随后转入含有头孢霉素的抑菌培养基中进行抑菌培养,再将子叶移入含有卡那霉素浓度的筛选培养基中进行抗性芽选择,并提取植物基因组DNA进行目的基因的PCR验证,从而建立高效的羽衣甘蓝遗传转化体系。结果表明:最佳的外植体是羽衣甘蓝的子叶,在培养基MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1上,不定芽分化率可达100%;子叶经2～3d预培养,将OD600值为0.3～0.5的携带DFR基因表达载体的农杆菌菌液离心,以50mL MS重悬液重悬,侵染外植体5min,共培养2d;采用头孢霉素300mg·L-1,抑菌培养3d后,采用10mg·L-1卡那霉素进行抗性芽选择。在播种后30～40d共获得了24个抗性芽,以抗性芽的基因组DNA为模板进行PCR扩增,9株呈DFR阳性,显示外源基因已经成功整合到羽衣甘蓝基因组中,平均转化率为37.5%。本研究结果可以为羽衣甘蓝重要性状基因的遗传转化提供依据。     

树莓遗传转化体系的建立与优化

【目的】树莓遗传转化体系的建立对研究其基因功能、性状形成机制等方面的生物学探索和育种改良方面的研究具有重要意义。【方法】建立2套稳定的遗传转化系统,系统1为叶片直接分化丛生芽遗传转化受体系统;系统2为树莓叶片脱分化形成愈伤组织再分化成芽遗传转化受体系统。【结果】转化效率分析结果显示,系统1转化率为25%,是系统2的2.1倍,抗性筛选获得阳性植株时间是系统2的50%。【结论】系统1具有更高的遗传转化效率。     

建立甜高粱(Sorghum bicolor)高频、高效再生体系的研究

【目的】建立能源植物甜高粱(Sorghum bicolor L.Moench)的高频、高效离体培养再生体系,为遗传转化奠定基础。【方法】以甜高粱品种凯勒的芽顶端分生组织为外植体,探讨在甜高粱直接诱导丛生芽的培养过程中,无菌实生苗的适合苗龄,适宜的激素组合与比例;并将获得的最佳培养方法应用于其它两个甜高粱品种:M-81E和意达利,以研究此途径的基因型依赖性。【结果】利用3d苗龄的芽顶端分生组织作为外植体容易获得较高的分生组织膨大率。甜高粱丛生芽诱导的适宜激素组合为4.0mg·L-16-苄基腺嘌呤+0.5mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸+0.5mg·L-1噻重氮苯基脲,可获得91%的丛生芽诱导频率。适合甜高粱快速生根的激素配方为0.5mg·L-1萘乙酸。通过芽顶端分生组织直接诱导丛生芽途径,每个外植体可诱导出上百个芽,最终产生30—40株再生苗。M-81E和意达利具有与凯勒相似的丛生芽诱导频率及效率。【结论】本研究成功地建立了甜高粱的高频、高效离体培养再生体系,且具有外植体来源不受限制,基因型依赖性弱,遗传稳定性好的优点。     

矮牵牛细胞的长期离体培养及再生植株的ISSR分析

 【目的】实现矮牵牛细胞的长期离体培养和再生，不但可以获得矮牵牛体细胞突变体，从中选出优良株系，而且可以为研究外源基因在矮牵牛细胞增殖与分化过程中的稳定性提供技术体系。【方法】以重瓣矮牵牛叶片为外植体，使用不同浓度BA与NAA的组合在黑暗条件下诱导愈伤组织。在不同光条件下，将愈伤组织在MS+ BA 2.0 mg•L-1+0.5 mg•L-1 NAA+200 mg•L-1 CH 与 MS+ BA 0.5 mg•L-1+0.5 mg•L-1 NAA+200 mg•L-1 CH两种培养基进行愈伤组织3年多的继代培养，并利用筛选的8个引物对20个再生植株的总DNA进行ISSR分析。【结果】不同的生长素与分裂素配比诱导的愈伤组织状态明显不同，继代后的愈伤组织在低激素培养基上分化出不定芽，再生芽复壮后可得到正常植株。对再生植株的总DNA进行ISSR分析发现，再生植株之间存在很大的遗传变异。【结论】矮牵牛愈伤组织在高BA浓度培养基上可长期继代保存；在低激素培养基上可实现植株再生。长期离体培养矮牵牛是获得其突变体的有效方法。     

根癌农杆菌介导柞蚕抗菌肽D基因转化柑桔的研究

 以含有双元载体（携带人工合成的柞蚕抗菌肽D基因、npt-Ⅱ基因和nos基因）的根癌农杆菌菌株SE转化锦橙、新会橙（Citrus sinenis Osbeck）、沙田柚（C.grandis）的上胚轴和子叶外植体，经共培养和预培养后在含卡那霉素（Km）的诱芽培养基中诱导并筛选Km抗性芽。探明了柑桔品种（基因型）、预培养时间和不同的芽伸长培养基对Km抗性芽诱导和伸长的影响。抗性芽经伸长培养后在含Km的生根培养基中生根或经离体微嫁接，获得了转化植株。Southern blot分析证明柞蚕抗菌肽D基因已整合到3个柑桔品种的基因组。