Smads与Hippo通道中YAP1基因在湖羊肌肉组织中时空表达研究及关联分析

【目的】通过在mRNA表达水平检测TGF-β/smad信号通路基因在湖羊肌肉组织中时空表达,来探究各基因的表达规律及内在联系。【方法】利用荧光定量PCR技术对湖羊Smads基因在出生后不同生长阶段（2日龄,2月龄和6月龄）不同性别的两种不同骨骼肌（腓肠肌、趾长伸肌）的相对表达进行分析,以及对湖羊Smad家族（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）基因、YAP1基因的表达相关性分析。【结果】湖羊肌肉TGF-β/smad信号通路中Smads基因时空表达规律研究发现：Smads在不同肌肉组织的表达分析中,Smads在腓肠肌中的表达高于趾长伸肌,可能与这两种骨骼肌分属不同部位有关;Smads在不同月龄的表达分析中,Smad2、Smad3、Smad4在2日龄的表达量均高于其它月龄,而Smad7在2日龄的表达量低于6月龄,2月龄时表达量最低;在不同性别的表达分析中,Smads在2日龄公羊中的表达量高于母羊,Smad2、Smad4、Smad7在2月龄和6月龄则低于母羊;Smad3在不同生长阶段中公羊表达量高于母羊。湖羊肌肉TGF-β/smad信号通路中Smads、YAP1基因表达相关性研究发现：在2日龄腓肠肌中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在2月龄腓肠肌中,Smad2的表达与YAP1存在显著正相关（P＜0.05）,Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在6月龄腓肠肌中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在腓肠肌的不同生长阶段中,Smad3的表达YAP1存在极显著负相关（P＜0.01）,Smad2、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）。在2日龄趾长伸肌中,Smad3的表达与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）,Smad2、Smad4、Smad7的表达与YAP1存在显著正相关（P＜0.05）;在2月龄趾长伸肌中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在6月龄趾长伸肌中, Smad7与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）;Smad2、Smad3、Smad4的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在趾长伸肌的不同生长阶段中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）。【结论】由此推断不同组织、生长阶段以及性别等因素均可影响Smads在肌肉中的表达;在湖羊这两种不同肌肉组织中,Hippo通道中YAP1基因可通过参与调控TGF-β/smad信号通路而参与肌肉的增殖和分化过程。     

益生菌对载鸭水体和产蛋性能的影响及其分子机制

【目的】研究饲粮添加芽孢杆菌和载鸭水体应用光合细菌对载鸭水体和鸭产蛋性能的影响及其分子机制。【方法】采用“地面平养＋水池”养殖模式,以2×2因子试验设计,选择同批次连城白鸭和樱桃谷鸭杂交后代蛋鸭240只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复10只,每个重复独立一栏。两处理因子分别为饲粮添加有效活菌含量为8×10⁷ cfu/kg的枯草芽孢杆菌和载鸭水体应用光合细菌至水体有效活菌含量为1.8×10¹² cfu/m³。对照组为不应用芽孢杆菌和光合细菌,光合组为只应用光合细菌,芽孢组为只添加芽孢杆菌,联合组为既添加芽孢杆菌又应用光合细菌。预饲7 d,试验期120 d。试验期间统计每10 d的平均产蛋率、平均采食量和平均料蛋比;每10 d采集水样用于检测大肠杆菌和沙门+志贺氏菌数量;每15 d采集水样和血样用于检测内毒素浓度。试验结束时,采集新鲜粪样用于检测大肠杆菌和沙门+志贺氏菌数量;取十二指肠、空肠和回肠黏膜用于检测内毒素水平;取空肠、回肠和脾脏组织用于炎症和凋亡相关基因表达。试验鸭自由饮用池水、自由采食、自然光照。水体和血液内毒素、采食量、产蛋率、料蛋比、水体大肠杆菌和沙门+志贺氏菌数据采用重复测量的线性混合模型分析,LSD修正法多重比较。粪便微生物数量、肠道黏膜内毒素水平和组织基因表达数据采用单因子方差分析,Duncan法多重比较。【结果】芽孢杆菌和光合细菌不显著影响鸭采食量（P＞0.05）、空肠Caspase-3和Bcl-2 mRNA表达（P＞0.05）、回肠Bcl-2 mRNA表达（P＞0.05）、以及脾脏IL-1β mRNA表达（P＞0.05）,但芽孢杆菌和光合细菌显著提高蛋鸭产蛋率（P ＜0.001）,显著降低蛋鸭料蛋比（P＜0.001）、载鸭水体（P＜0.001）、十二指肠（P＜0.01）和回肠（P＜0.01）内毒素浓度、粪便大肠杆菌数（P＜0.001）、空肠TLR4（P＜0.05）和回肠Caspase-3（P＜0.05）mRNA表达水平。采食量、产蛋率、料蛋比、水体大肠杆菌、沙门+志贺氏菌和内毒素水平存在显著的时间效应（P＜0.001）。与芽孢组和联合组相比,对照组和光合组血液内毒素和粪便沙门+志贺氏菌数量显著提高,对照组空肠粘膜内毒素水平、载鸭水体沙门+志贺氏菌数量以及脾脏TNF-α mRNA表达水平显著提高。联合组水体大肠杆菌数量显著低于对照组、光合组和芽孢组。仅联合组回肠TLR4 mRNA表达水平显著低于对照组,脾脏IL-10 mRNA表达水平显著高于对照组。【结论】芽孢杆菌和光合细菌可能通过降低载鸭水体革兰氏阴性菌数量和内毒素水平、降低肠道和血液内毒素浓度、降低炎症反应和肠道细胞凋亡,提高蛋鸭产蛋性能。     

HOPX基因过表达对鸡前脂肪细胞增殖的影响

【目的】构建鸡HOPX基因（homeodomain only protein X）全长编码区（coding region sequence, CDS）的真核表达载体,转染鸡原代前脂肪细胞,探讨HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计鸡HOPX基因CDS区上、下游引物,以AA肉鸡腹部脂肪组织的cDNA为模板,采用PCR扩增、克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并将其亚克隆至真核表达载体（pCMV-HA vector）,获得HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX。采用双酶切鉴定、测序及Western blotting方法分析鉴定pCMV-HA-HOPX。采用胶原酶法分离培养12日龄AA商品肉仔鸡腹部脂肪组织原代前脂肪细胞,瞬时转染pCMV-HA-HOPX,转染6 h时后消化细胞,按照每孔50 000个细胞数接种12孔培养板,并在细胞贴壁0、24、48和72 h,分别采用显微镜观察和CCK-8细胞增殖检测试剂盒分析HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响;同时,利用TRIzol法提取组织和细胞总RNA,并反转录合成cDNA,采用Real-time RT-PCR方法分析细胞增殖标志基因Cyclin D1和PCNA的mRNA表达。【结果】测序结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区大小为222 bp,与NCBI发布的鸡HOPX基因mRNA序列（NM_204556）一致;利用HA标签抗体的Western blotting分析显示,真核表达载体pCMV-HA-HOPX能够表达出预期大小的蛋白分子（约9.5kD）,表明鸡HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX构建成功。显微镜观察发现,转染pCMV-HA-HOPX载体的细胞（HOPX过表达组）在细胞贴壁后培养24和48 h的细胞数量低于转染pCMV-HA vector空载体（空载体对照组）的细胞数量;CCK-8检测分析发现,转染pCMV-HA-HOPX载体细胞的吸光度值（OD值）在细胞贴壁后培养24、48和72 h都极显著低于空载体对照组（P＜0.01）。与细胞增殖检测结果相一致,细胞增殖标志基因表达检测分析发现,在细胞贴壁后培养24 h后,HOPX过表达组细胞Cyclin D1基因的mRNA表达量显著低于空载体对照组（P＜0.05）;在细胞贴壁后培养48 h时,HOPX过表达组的PCNA基因的mRNA表达量显著低于空载体对照组（P＜0.05）;在细胞贴壁后培养72 h时,HOPX过表达组的PCNA和Cyclin D1基因的表达量均极显著低于空载体对照组（P＜0.01）。【结论】HOPX基因过表达在体外抑制鸡原代前脂肪细胞的增殖。     

玉米赤霉烯酮对断奶小母猪子宫形态学及热应激蛋白70分布和表达的影响

【目的】研究不同水平玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）对断奶小母猪子宫形态学和子宫内热应激蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）的阳性分布规律及mRNA相对表达量的影响。【方法】选择25-28日龄健康三元杂交（杜×长×大）断奶小母猪40头,产床上适应环境10 d后转入单体笼（0.48 m²）。根据日龄（35-38）和平均体重（14.01 ± 0.86 kg）,将40头试验小母猪分为4个处理,每个处理10个重复,每个重复1头猪。对照组（Control）饲喂基础饲粮,处理1（ZEA0.5）、处理2（ZEA1.0）和处理3（ZEA1.5）分别在基础饲粮基础上添加0.5、1.0和1.5 mg·kg^-1的ZEA（ZEA的测定值分别为0、0.52±0.07、1.04±0.03和1.51 ± 0.13 mg·kg^-1）,小母猪单笼饲养,自由采食和饮水,预饲期10 d,正式期35 d。试验结束前一天对小母猪禁食12 h,全部放血屠宰,打开腹腔后无菌条件下迅速切取一份子宫组织置于2 mL无RNA酶的冻存管中液氮速冻,而后转至-80℃冻存,检测HSP70的mRNA相对表达量,另切取子宫组织块迅速固定于Bouin’s液,待做组织切片检测子宫形态学的结构和HSP70的阳性分布规律。【结果】随着饲粮中ZEA水平的升高,子宫肌层和内膜明显增厚,子宫腺数量明显增多,子宫腺密度明显增大;子宫肌层和内膜厚度随着饲粮中ZEA水平的升高呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.001）线性升高,1.5 mg·kg^-1 处理的子宫肌层和内膜厚度显著高于1.0 mg·kg^-1处理（P＜0.05）,1.0 mg·kg^-1处理显著高于0.5 mg·kg^-1处理（P＜0.05）,0.5 mg·kg^-1处理又显著高于对照组（P＜0.05）。免疫组化结果显示,HSP70免疫阳性物质主要分布于子宫肌层平滑肌细胞、子宫腺上皮细胞、腔上皮细胞和血管内皮细胞的胞质内,偶见胞核着色。对照组免疫阳性较弱呈浅黄色,随着饲粮中ZEA水平的升高,HSP70免疫阳性反应明显增强,颜色加深,呈黄色和棕黄色块状分布。断奶小母猪子宫中肌层、腺上皮、腔上皮及所测部分总HSP70免疫阳性物质的累积光密度（integrated optical density,IOD）随着饲粮中ZEA水平的升高均呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.05）线性升高;总体上,1.5 mg·kg^-1 处理的子宫HSP70免疫阳性物质的IOD显著高于0.5 mg·kg^-1处理（P＜0.05）,0.5和1.0 mg·kg^-1处理又显著高于对照组（P＜0.05）。mRNA相对表达量结果显示,随着饲粮中ZEA水平的升高,断奶小母猪子宫内HSP70的mRNA相对表达量呈一次、二次线性升高（P＜0.001）,尽管1.0 mg·kg^-1和1.5 mg·kg^-1处理差异不显著（P＞0.05）,但1.5 mg·kg^-1 处理显著高于0.5 mg·kg^-1处理（P＜0.05）,0.5 mg·kg^-1处理又显著高于对照组（P＜0.05）。【结论】饲粮中0.5 mg·kg^-1 ZEA足以使子宫肌层和内膜明显增厚,子宫腺数量明显增多,使得子宫形态发生改变;本试验条件下,随ZEA浓度升高,HSP70免疫阳性反应增强,诱导子宫内HSP70的高水平表达,抵抗毒素应激对子宫细胞的损伤。     

舍内不同氨气浓度对肉鸡抗氧化性能及肉品质的影响

【目的】探讨鸡舍内不同氨气浓度对肉鸡抗氧化性能和肉质性状的影响。【方法】采用单因素完全随机设计,将400只21日龄健康艾拔益加（AA）肉公鸡,随机分在4个呼吸代谢舱中,每个舱为1个处理,每个处理设4个重复,每个重复25只鸡。4个处理组分别为：对照组氨气浓度控制在＜3 mg·kg-1,试验组氨气浓度分别控制在(25±3)、(50±3)和(75±3) mg·kg-1。呼吸代谢舱采用全自动化控制养殖环境条件。试验期为21 d,21-31 d为试验前期,32-42 d为试验后期。肉鸡采用网上平养,自由采食和饮水。分别在32 d和42 d屠宰取样,测定肉鸡血液、肌肉、肝脏的抗氧化性能以及肉质性状。【结果】1）抗氧化性能：在21-31日龄阶段,随着鸡舍氨气浓度的升高,肉鸡血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性呈二次曲线增加（P＜0.05）,总抗氧化能力（total antioxidation capacity,T-AOC）活性和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量呈线性增加（P＜0.05）;胸肌过氧化氢酶（catalase,CAT）活性和MDA含量具有呈线性增加的趋势（0.05＜P＜0.10）,而T-AOC活性呈线性降低（P＜0.05）;腿肌T-AOC活性有呈线性增加的趋势（0.05＜P＜0.10）,75 mg·kg^-1氨气处理组SOD活性显著高于对照组（P＜0.05）;肉鸡肝脏CAT活性具有线性降低的趋势（0.05＜P＜0.10）,MDA含量呈现线性增加（P＜0.05）。在32-42日龄阶段,随着鸡舍氨气浓度的升高,肉鸡血清谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性呈二次曲线降低（P＜0.05）,CAT活性呈线性降低（P＜0.05）,50 mg·kg^-1氨气处理组SOD活性显著低于对照组（P＜0.05）;胸肌CAT活性呈线性增加（P＜0.05）,T-AOC活性呈二次曲线降低（P＜0.05）;腿肌GSH-Px活性呈二次曲线增加（P＜0.05）,75 mg·kg^-1 氨气处理组腿肌SOD活性显著高于其他各组（P＜0.05）;肝脏T-AOC活性具有呈二次曲线增加的趋势（0.05＜P＜0.10）,GSH-Px活性呈线性降低（P＜0.05）。（2）肉质性状：在21-31日龄阶段,随着氨气浓度的升高,肉鸡胸肌剪切力和肉色b*值呈线性降低（P＜0.05）,L*值呈线性升高（P＜0.05）;腿肌肉色L*值呈线性降低（P＜0.05）,肉色a*值和宰后24 h的pH值呈二次曲线增加（P＜0.05）,b*值具有线性降低的趋势（0.05＜P＜0.10）。在32-42日龄阶段,随着氨气浓度的升高,肉鸡胸肌剪切力和肉色a*值呈线性降低（P＜0.05）,b*值与屠宰后24 h肉质pH值均呈线性升高（P＜0.05）,50 mg·kg^-1氨气处理组胸肌肉色L*值显著高于其他各组（P＜0.05）;宰后45 min腿肌pH具有呈二次曲线增加的趋势（0.05＜P＜0.10）。【结论】鸡舍高浓度氨气可降低肉鸡的抗氧化能力,影响鸡肉品质,且随氨气浓度的升高而逐渐增强,具有时间累加效应。     

鸭骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

为建立鸭骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定方法,以高邮鸭13胚龄的胸肌和腿肌为材料,采用混合酶消化法和差速贴壁法分离纯化骨骼肌卫星细胞,用特异性标志Pax7对纯化细胞进行免疫荧光鉴定.结果表明胸肌和腿肌都能成功获取骨骼肌卫星细胞,细胞增殖旺盛,分化良好;纯化后的细胞免疫荧光鉴定阳性率达95％.表明该技术能成功分离和鉴定鸭骨骼肌卫星细胞,为以后骨骼肌卫星细胞相关研究提供了技术平台.     

GmHMADP参与高温高湿下大豆种子活力形成及铜镉胁迫响应的研究

【目的】高温高湿、重金属等非生物胁迫是制约大豆生产,影响种子发育和品质的重要因素。通过对大豆GmHMADP的研究,揭示其在重金属镉、铜和高温高湿胁迫下的表达水平以及功能,以期为培育高活力的逆境耐受性大豆新品种提供理论依据和实践基础。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计引物,以宁镇1号和湘豆3号2个品种叶片的cDNA为模板,分离大豆GmHMADP全长cDNA序列。通过NCBI网站BLAST对GmHMADP同源性氨基酸序列进行搜索,并用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对。同时,以XhoⅠ和SalⅠ为酶切位点构建35S::GmHMADP-GFP融合表达载体,分析其在烟草叶肉细胞的瞬时表达,进行亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术对GmHMADP的组织特异性表达及其在高温高湿和CuSO₄、CdCl₂处理下的表达进行分析。以XbaⅠ和BamHⅠ为酶切位点,利用pBI121载体,构建融合表达载体,将GmHMADP在野生型拟南芥中过表达,获得3个纯合的T3转基因株系,对高温高湿胁迫下拟南芥的种子活力以及过表达拟南芥植株对铜、镉胁迫的耐受性进行分析。【结果】获得大豆GmHMADP全长cDNA序列,该基因包含1个996 bp的完整开放阅读框,具有4个外显子和3个内含子。多序列比对结果表明,GmHMADP氨基酸序列含有2个金属离子结合位点特征序列CXXC。亚细胞定位结果表明GmHMADP蛋白定位于细胞膜与细胞核上。组织特异性分析结果表明,GmHMADP在宁镇1号和湘豆3号2个品种的发育和成熟中的种子中表达量较高。与相应的对照组相比,在宁镇1号种子中,高温高湿胁迫48、96和168 h后,GmHMADP的表达量显著（P ＜0.01）升高;在抗性品种湘豆3号中,该基因在处理24、48、96和168 h时表达量显著（P ＜0.01）升高;湘豆3号中,GmHMADP的表达量在不同浓度Cu²⁺、Cd²⁺的诱导下均显著（P ＜0.01）升高;而宁镇1号中,GmHMADP的表达量仅在50 μmol·L^-1 Cu²⁺和200 μmol·L^-1 Cd²⁺处理下显著（P＜0.01）升高。GmHMADP过表达拟南芥株系经高温高湿胁迫后的发芽势、发芽率及种子活力均显著（P＜0.01）高于野生型植株;经Cu、Cd胁迫后,转基因拟南芥株系的根长和干重均显著（P＜0.05）高于野生型植株。【结论】GmHMADP参与高温高湿胁迫下种子活力的形成并响应Cu、Cd胁迫,在拟南芥中过表达GmHMADP可提高拟南芥的种子活力以及对Cu、Cd胁迫的耐受性。     

多转座子载体的构建及转座特性比较研究

【目的】转座子（transposon, Tn）是染色体上可自主复制和移位的基本单位,普遍存在生物体基因组内,Sleeping beauty（SB）、piggyBac（PB）和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼,是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率,从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol2 3种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件,测序正确后,将各转座元件依次亚克隆至pT2-HB载体框架,构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新霉素表达框PGK-NEO分别克隆至pT3-PST载体,获得两个表达载体pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒pCMV-SB100X、 pCMV-HAhyPBase、pCMV-Tol2以1﹕1质量比混合,经多聚阳离子PEI包裹,共转染小鼠胚胎成纤维细胞（3T3）,同时以突变失活的转座酶质粒SB△DD与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染GFP 36 h后,用荧光显微镜进行检测GFP表达率,提取细胞基因组,以Amp基因作为内参,进行实时荧光定量PCR,检测GFP插入拷贝数;根据被剪切位置上下游序列设计引物,进行实时荧光定量PCR,检测3种转座子的剪切效率。细胞转染NEO 48 h后,用浓度为500 µg·mL^-1的G418进行耐药性筛选,至正常细胞基本全部死亡（10 d）,将细胞进行吉姆萨染液染色,统计耐药细胞数,从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于50%,且差异不显著（P＞0.05）。SB组GFP相对拷贝数高于Tol2和PB组,但差异不显著（P＞0.05）,均显著高于对照组（P＜0.05）。SB和PB组剪切效率显著高于Tol2组（P＜0.05）,但SB和PB组之间差异不显著（P＞0.05）。pT3-PGK-NEO与转座酶共转染3T3细胞,G418抗性筛选结果表明,SB组耐药细胞数显著高于PB和Tol2组（P＜0.05）,但PB和Tol2两组差异不显著（P＞0.05）,此3组均极显著高于阴性对照组（P＜0.01）。【结论】SB转座子系统在细胞水平的转座效率优于PB和Tol2,为细胞水平的转基因研究提供有效基因转移工具。     

罗伊氏乳杆菌I5007对新生仔猪肠道形态、二糖酶活性和紧密连接蛋白表达的影响

【目的】罗伊氏乳酸杆菌是普遍存在于人和动物肠道的有益乳酸杆菌,研究表明,口服罗伊氏乳酸杆菌能显著降低腹泻的发病率和严重程度。研究罗伊氏乳酸杆菌I5007（Lactobacillus reuteri I5007）对新生仔猪肠绒毛发育和肠黏膜屏障功能的影响。【方法】试验选取9窝1日龄的杜×长×大初生仔猪,每窝挑选8头体重相近、出生状况良好的仔猪,按体重分为3组,每组3窝仔猪。即：对照组（灌服0.1%无菌蛋白胨溶液）,前4日龄灌服组（1-4 d,每日每头灌服活菌总数为1.2×10¹⁰ CFU 的L. reuteri I5007）和隔4日龄灌服组（1、5、9、13、17和21 d灌服,灌服剂量同前4日龄灌服组）。试验期21 d,试验期间仔猪由各自母猪哺乳饲喂。于试验第7、14和21 天,每个处理组随机选取4头仔猪,空腹称重、麻醉和屠宰,截取相同位置的十二指肠、空肠和回肠,测定其肠绒毛形态,并测定试验结束时（21 d）空肠和回肠二糖酶活性和紧密连接（TJ）蛋白的表达。【结果】灌服L. reuteri I5007对仔猪生长性能没有显著影响（P＞0.05）,但对不同阶段仔猪的肠道形态有不同程度的影响。7 d时,隔4日龄灌服组与对照组相比,仔猪十二指肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度、杯状细胞数和回肠杯状细胞数均显著增加（P＜0.05）,前4日龄灌服组仔猪的十二指肠绒毛高度/隐窝深度、杯状细胞数和回肠杯状细胞数也均显著高于对照组仔猪（P＜0.05）,但对十二指肠绒毛高度无显著影响（P＞0.05）;14 d时,隔4日龄灌服组仔猪十二指肠的绒毛高度/隐窝深度和回肠杯状细胞数均显著高于对照组（P＜0.05）,前4日龄灌服组仔猪的回肠杯状细胞数也显著高于对照组（P＜0.05）,但却低于隔4日龄灌服组（P＜0.05）;21 d时,隔4日龄灌服组显著提高了仔猪十二指肠和回肠的杯状细胞数（P＜0.05）,前4日龄灌服组与对照组相比,仅提高了回肠杯状细胞数（P＜0.05）,反而降低了十二指肠绒毛高度/隐窝深度（P＜0.05）。另外,前4日龄灌服组仔猪空肠隐窝深度显著低于隔4日龄灌服组仔猪（P＜0.05）,但其十二指肠杯状细胞数和绒毛高度/隐窝深度均显著低于隔4日龄灌服组仔猪（P＜0.05）。在二糖酶活性上,隔4日龄灌服组仔猪空肠蔗糖酶和麦芽糖酶活性均显著高于对照组（P＜0.05）,前4日龄灌服组仅提高了仔猪空肠麦芽糖酶活性（P＜0.05）,且该组空肠蔗糖酶活性和麦芽糖酶活性均显著低于隔4日龄灌服组（P＜0.05）。隔4日龄灌服组对仔猪空肠和回肠的3种TJ蛋白（Claudin-1、Occludin和ZO-1）均有显著的促表达作用（P＜0.05）,前4日龄灌服组仔猪空肠Claudin-1、ZO-1和回肠Claudin-1的表达也均高于对照组（P＜0.05）,但是其空肠Occludin显著低于隔4日龄灌服组（P＜0.05）,且其回肠Claudin-1（P = 0.1）和ZO-1（P = 0.1）相比于隔4日龄灌服组也有降低的趋势。【结论】本试验条件下,新生仔猪隔4日龄灌服L. reuteri I5007（1.2×10¹⁰ CFU/头/日）,能有效促进仔猪肠绒毛发育,提高空肠二糖酶活性,促进仔猪肠上皮细胞TJ蛋白的表达,在改善新生仔猪的肠黏膜屏障功能中可能起到一定的作用。     

氟喹诺酮类药物多残留酶联免疫检测方法的建立

【目的】氟喹诺酮类药物（FQs）在畜牧业中广泛用于预防和治疗细菌性疾病,不合理使用导致在动物性食品中残留,严重危害消费者健康,其检测受到世界各国重视。制备抗多种FQs单克隆抗体（mAbs）,建立间接竞争ELISA（icELISA）检测方法,为动物性食品中FQs多残留检测奠定基础。【方法】环丙沙星（CPFX）羧基上引入氨基丁酸后为半抗原（CPFX-A）,质谱鉴定;分别用碳二亚胺法（DDC）和混合酸干法将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成免疫原（CPFX-A-BSA）和包被原（CPFX-A-OVA）,紫外和红外光谱鉴定是否偶联成功;CPFX-A-BSA 免疫Balb/c小鼠,间接ELISA和icELISA方法测定多抗血清效价和敏感性,选取抗血清效价高和敏感性好的鼠用于细胞融合;NS0细胞和脾细胞按1﹕5比例在PEG-1500作用下融合,筛选抗FQs杂交瘤细胞株,并进行效价、亚型、敏感性和交叉反应率鉴定;体内诱生腹水法制备mAb,液体石蜡作为诱导剂,每只鼠注射10⁸个杂交瘤细胞;选敏感性和广谱特异性好的腹水mAb,建立icELISA标准曲线,对icELISA检测方法优化,在鸡肉中添加10种FQs进行测定,将测定结果与HPLC法比较,用SPSS 17.0软件进行显著差异性分析。【结果】半抗原改造和人工抗原合成成功;3只鼠血清效价均达到1﹕1.28×10⁴以上,2号鼠血清效价最高（1﹕2.56×10⁴）,且IC₅₀值最低（12.92 ng·mL^-1）,选择2号鼠作为细胞融合用鼠;4次亚克隆筛选并鉴定后获得3株敏感广谱特异的杂交瘤细胞,分别命名为2H5、3D11、4F4,细胞上清效价分别为1﹕1 600、1﹕1 600和1﹕800,腹水效价分别为1﹕1.6×10⁶、1﹕8.2×10⁵和1﹕8.2×10⁵;icELISA方法的包被原浓度为1 μg·mL^-1,5%猪阴性血清4℃包被过夜,单抗1﹕40 000稀释,山羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP） 1﹕8 000稀释;反应温度均为37℃,标准品与单抗同时加入反应15 min,洗板后加二抗反应25 min;显色10 min,2H5细胞株腹水敏感性和广谱特异性最好,2H5的线性回归方程为y=-28.022x+56.219,R²=0.9 782,对10种FQs的IC₅₀值分别为环丙沙星（CPFX）1.67 ng·mL^-1、诺氟沙星（NOR）1.82 ng·mL^-1、培氟沙星（PEF）1.97 ng·mL^-1、恩诺沙星（ENR）1.54 ng·mL^-1、单诺沙星（DAN）2.79 ng·mL^-1、洛美沙星（LOM）3.38 ng·mL^-1、氧氟沙星（OFL）5.50 ng·mL^-1、麻保沙星（MAR）4.40 ng·mL^-1、沙拉沙星（SAR）11.76 ng·mL^-1、二氟沙星（DIF）13.60 ng·mL^-1,与10种FQs的交叉反应率为12.3%-108.4%,与非FQs交叉反应率均低于0.01%,对10种FQs的检测限（LODs）为0.09 ng·mL^-1-0.64 ng·mL^-1。icELISA法鸡肉中10种FQs的回收率为80.5%-91.8%,HPLC法的回收率为85.1%-95.7%,二者变异系数均低于10.0%;两种检测方法差异不显著（P＞0.05）。【结论】该试验获得了高效价、敏感、广谱特异性的mAbs,建立的icELISA方法可用于同时检测鸡肉中10种FQs。     

牛LncRNA-133a对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

【目的】 探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】 利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a） 或LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a） 转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC 基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】 组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中（D0-D3）,肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时（D2）表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期（D0）：与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加（P<0.01）,而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少（P<0.01）;在分化48 h时（D2）：与对照组相比,LncRNA-133a过表达处理组肌细胞分化标记因子MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Western blotting检测MHC蛋白表达量显著增加（P<0.01）,且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低（P<0.05）, MHC蛋白表达量显著减少（P<0.01）,同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】 研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。     

阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制 猪骨骼肌卫星细胞分化

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1-3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。 待细胞汇合至70%-80%时,将培养基换成含50 nmol•L-1 渥曼青霉素（wortmannin,WM）的分化培养基,分别于细胞分化第0天、第4天和第8 天收集细胞,提取总RNA和总蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁,呈梭形。第4天细胞数量增加,部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化（P＞0.05）,非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）,而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降（P＜0.05）。WM处理组的细胞在分化第8天,虽然也出现了蜂窝状生长,但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示,WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化,抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化,延迟肌管的形成,并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之,阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。     

转卵泡抑制素基因对绵羊肌源性细胞中 肌肉抑制素基因的调控

【目的】构建骨骼肌特异表达目的基因卵泡抑制素（follistatin,FST）的真核表达载体pCFCDs-red和 pSPFCDs-red,分别转染到不同细胞系中,检测FST及下游基因在RNA和蛋白水平的表达情况,同时测定骨骼肌特异启动子SP和α-actin的启动效率,以研究FST的特异表达对肌肉发育的影响。【方法】利用脂质体分别将真核表达载体pCFCDs-red和pSPFCDs-red转染到绵羊胎儿成纤维细胞（SFFCs）、骨骼肌卫星细胞（SMSCs）和SMSCs诱导肌管中,获得转基因细胞;对获得细胞的生长状况、细胞周期、细胞形态大小以及目的基因和下游基因的表达情况,分别用流式细胞仪、实时定量PCR和western blotting等方法进行检测分析。【结果】①转基因细胞系的生长趋势与非转基因细胞相似,转基因SMSCs细胞增殖的速度高于转基因SFFCs细胞;②流式细胞仪分析表明,转基因细胞系转染后70%以上细胞均处于G0/G1期,保持旺盛的分裂能力、具有单一峰值、细胞的整倍性好、细胞电子体积显著增大;③实时定量PCR及western blotting检测结果表明,转基因细胞系中FST的RNA及蛋白水平相比非转基因细胞系均上调;④转基因SMSCs和肌管相比转基因SFFCs细胞的FST表达量高,转pSPFCDs-red转基因细胞中FST的表达水平比转pCFCDs-red细胞系高。【结论】骨骼肌特异性启动子SP及α-actin能够在SMSCs及肌管中有效启动FST目的基因的表达,且在肌管中具有较高的表达量,SP启动子的启动效率较高于α-actin。在肌源性细胞中,FST的上调可以引起MSTN蛋白水平的下调,FST对骨骼肌细胞的生长发育具有一定促进作用。     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基（proteasome subunit beta type-5, PSMB5）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting 法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNA si-RNA-PSMB5（si-PSMB5）,构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5（pcDNA-PSMB5）,采用（Lipofectamine）3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期（P<0.05）。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著（P>0.05）。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）;而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05）。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。     

miR-486对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖及PI3k-Akt信号通路相关基因表达的影响

【目的】明确miR-486对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖及PI3K-Akt信号通路相关基因表达的影响,为揭示miR-486对绵羊骨骼肌发育的调控机制打下基础。【方法】以巴什拜羊1日龄羔羊后肢骨骼肌卫星细胞为研究对象,通过转染miR-486 mimics和miR-486 inhibitor致使绵羊骨骼肌卫星细胞中miR-486水平上调或下调,探究miR-486对骨骼肌卫星细胞增殖速度及PI3K-Akt信号通路中PTEN、GSK3b、PRKCα、Raf-1、MAPK1、PKN1、Casp9和SGK1等8个相关基因表达变化的影响。【结果】空白对照及转染miR-486 mimics、miR-486 mimics negative control和miR-486 inhibitor negative control的绵羊骨骼肌卫星细胞均表现出典型的S形增殖曲线,但各处理间的细胞增殖速度存在明显差异。当绵羊骨骼肌卫星细胞中miR-486水平上调可促使细胞进入快速增殖状态,而miR-486水平下调可使细胞保持静止状态。实时荧光定量PCR检测结果表明,当绵羊骨骼肌卫星细胞中miR-486水平上调时,可引起PTEN、Raf-1和MAPK1基因相对表达量极显著下调（P<0.01,下同）,PRKCα和PKN1基因相对表达量极显著上调,SGK1基因相对表达量显著上调（P<0.05）;而GSK3β和Casp9基因相对表达量在不同处理组绵羊骨骼肌卫星细胞间的差异均不显著（P>0.05）,可能在维持绵羊骨骼肌卫星细胞基本生命活动中发挥作用。【结论】miR-486通过调控PI3K-Akt信号通路相关基因的表达而参与绵羊骨骼肌卫星细胞生长发育及增殖,为深入研究miR-486对绵羊骨骼肌发育的调控机理及优质肉羊品种培育打下了理论基础。     

EGF、EGFR在牦牛卵母细胞中的表达及对胚胎发育能力的作用

【目的】探明表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）及其受体（EGFR）在牦牛卵母细胞成熟过程中的表达动态,并且研究EGF对牦牛卵母细胞成熟的影响及可能的分子作用机制。【方法】采集牦牛卵巢,捡取质量较好的牦牛卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes,COCs）,进行体外成熟培养;分别处理未成熟和成熟的牦牛COCs,采用Real-time PCR和间接免疫荧光方法检测COCs成熟过程中EGF及EGFR在基因和蛋白水平的表达动态;牦牛COCs成熟培养时在基础培养基中分别添加0、50、100和200 ng·mL^-1 EGF及最佳作用浓度的EGFR抑制因子Gefitinib,比较作用前后卵母细胞成熟率、受精后卵裂率及囊胚率;Real-time PCR方法分析不同浓度EGF和Gefitinib作用后成熟COCs中凋亡相关基因Bax和Baxi的相对表达量。【结果】EGF,EGFR基因在成熟COCs的表达显著高于未成熟COCs,成熟COCs中EGF基因的相对表达量为未成熟COCs 的2.17±0.36倍,EGFR基因在成熟COCs的表达量为未成熟COCs 6.82±0.21倍,且在未成熟和成熟COCs中EGFR基因表达量均显著高于EGF。免疫荧光检测显示未成熟COCs和成熟COCs均表达EGF和EGFR蛋白,EGF和EGFR蛋白的标记荧光主要集中在卵丘细胞,卵母细胞表达较弱。100 ng·mL^-1 EGF可以显著提高COCs成熟率（73.45±2.09）%及其受精后的卵裂率（59.46±1.41）%和囊胚率（26.23±1.08）%;对照组中（0 EGF）COCs成熟率为(54.16±3.25)%,卵裂率为 (48.33±1.93)%,囊胚率为(15.34±0.43)%;EGF浓度为50 ng·mL^-1时成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(61.79±1.04)%、(51.76±0.61)%和(18.62±1.13)%;200 ng·mL^-1成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(71.26±4.18)%、(57.13±2.06 )% 和(23.96±0.53)%;而加入EGFR抑制因子Gefitinib显著的降低了COCs的成熟率及其受精后的卵裂率及囊胚率,分别为(43.63±1.46)%、(41.79±2.81)%和(12.65±0.67)%。COCs成熟过程中EGF的作用可以显著抑制促凋亡基因Bax的表达,在50 ng·mL^-1、100 ng·mL^-1、200 ng·mL^-1EGF作用后成熟COCs中Bax基因的相对表达量分别仅为对照组（0 EGF）的0.83±0.12,0.21±0.02,0.27±0.03倍,EGF浓度为100 ng·mL^-1时Bax基因表达量最低,而Gefitinib作用后可以显著促进成熟COCs中Bax基因的表达,其相对表达量为对照组的4.24±0.10倍;EGF在COCs成熟过程中可以显著促进抗凋亡基因Baxi的表达,其相对表达量在EGF浓度为50、100、200 ng·mL^-1EGF分别为对照组的2.18±0.12、7.06±0.59和6.73±0.31倍,EGF浓度为100 ng·mL^-1时Baxi基因表达量最高,而Gefitinib作用后可以显著降低成熟COCs中Baxi基因的表达,其相对表达量为对照组的0.32±0.04倍。【结论】EGF和EGFR作为牦牛COCs体外成熟过程中重要的自分泌因子,且外源的EGF可以显著提高卵母细胞成熟率、卵裂率及囊胚率,最佳作用浓度为100 ng·mL^-1,其作用机制可能与调控凋亡相关基因Bax和Baxi表达有关。     

北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。     

酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)基因表达的影响

【目的】探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的调节作用,为在分子水平上揭示益生菌对防御素的调控机理提供一定的理论基础及依据。【方法】首先将新鲜的绵羊瘤胃组织用PBS和抗生素处理后进行瘤胃上皮细胞原代培养,当原代细胞数量长到细胞培养瓶的85%以上时,将细胞传于12孔板用于细胞刺激试验。同时将活化并纯化后的酿酒酵母菌25℃、180 r/min有氧培养48 h后,进行5次平行平板计数试验,根据平板计数的数据处理方法,得到浓度为5.2×108CFU·m L-1的酿酒酵母菌液,再通过倍比稀释把所得菌液依次稀释成浓度为5.2×107、5.2×106、5.2×105、5.2×104CFU·m L-1的菌液,用以上不同浓度(5.2×104—5.2×108CFU·m L-1)的酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞分别进行不同时间(2、4、8、12、24 h)的刺激,并设置对照组用DMEM/F12培养基代替酿酒酵母菌。然后提取总RNA,逆转录为c DNA后,利用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测瘤胃上皮细胞中SBD-1表达差异。最后用SAS 9.2软件对数据进行相关差异性分析。【结果】荧光定量PCR结果表明,在各时间组内SBD-1 m RNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1时表达量达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 m RNA的表达量先是随着刺激时间的延长而呈上升趋势,刺激时间为12 h时SBD-1 m RNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU·m L-1的菌液刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P0.01)。ELISA检测结果显示,SBD-1蛋白表达趋势与SBD-1 m RNA检测结果基本一致。不同浓度的菌液分别刺激绵羊瘤胃上皮细胞2、4、8、12、24 h后均能提高共培养上清中SBD-1蛋白的表达,且与对照组相比存在极显著差异(P0.01)。在菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后SBD-1蛋白分泌水平达到最高,与此浓度下各时间组相比差异极显著(P0.01)。【结论】酿酒酵母菌能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1的表达量达到最高。     

褪黑素和烟酰胺单核苷酸对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的影响

【背景】目前关于褪黑素（melatonin,MLT）的研究多集中在家禽的生殖功能上,而与家禽肌肉发育相关的作用机制却鲜有研究。同时MLT与烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)功能相似且都与昼夜节律相关,研究发现MLT与NMN的单一处理对细胞衰老的影响有限,而共同处理的效果更为显著,虽然二者对线粒体功能和骨骼肌衰老的影响也有相关报道,但在骨骼肌生长发育的作用机制方面尚无可以参考的报道。【目的】通过探究MLT与NMN参与浙东白鹅骨骼肌卫星细胞增殖的分子机制,为其在家禽生产实践中的应用提供思路。【方法】通过解剖鹅胚分离培养鹅骨骼肌卫星细胞,并对骨骼肌卫星细胞的特异性蛋白Pax7和Desmin进行免疫荧光染色以此鉴定细胞,在体外成熟培养基础上用1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN分别单独或组合处理细胞24 h后,利用CCK-8检测细胞活力;为探究MLT如何调控鹅骨骼肌卫星细胞增殖的机制,通过构建MLT受体基因（MTNR1A、MTNR1B）的过表达载体,并与1 ng·mL-1 MLT共同处理细胞,采用qRT-PCR和Western b...