苏云金芽孢杆菌NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的克隆和敲除载体的构建

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含待敲除NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游片段、卡那霉素抗性基因的重组质粒pRN5101DKU,为后续Bt8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的敲除做准备.     

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因克隆与序列分析

根据蜡质芽孢杆菌(Bc)肠毒素基因序列,设计特异PCR引物,对本实验室保存的 16个苏云金芽孢杆菌 (Bt)菌株进行检测.结果显示, 15个菌株含有肠毒素基因片段.克隆了Bt8010肠毒素entS基因的编码框 (ORF)序列, 将该序列测序,用在线的BLAST软件与DNASIS软件进行同源性分析.结果表明,该基因与已知的Bc和炭疽芽孢杆菌肠毒素基因有很高的同源性,但该基因有 12个核苷酸缺失,不能表达完整多肽.     

Bt毒蛋白Cry1Ab受体基因Bt-r3在大肠杆菌中的克隆和表达及特性分析

根据二化螟中肠Bt毒蛋白Cry1Ab的受体基因Bt-r3的cDNA序列设计特异引物,扩增得到编码Bt-R3蛋白胞外部分的目的片段(约4500bp).将目的基因酶切克隆到质粒载体prcHis-TOPO上,再将该质粒导入到感受态细胞TOP 10,经IPTG诱导、得到约为160 kD的表达蛋白.经Western印迹鉴定,结果表明表达产物能有效地结合Bt毒蛋白Cry1Ab,从而确认Bt-r3是Cry1Ab的受体基因.它们的结合部位位于Bt-R3蛋白的胞外结构域中.     

苏云金芽胞杆菌cry1Ia32基因克隆和原核表达的研究

根据GenBank中cry1I类基因序列设计特异性引物,以Bt SC-13菌总DNA为模板PCR扩增得到2 151bp的cry1Ia全长基因。该基因编码蛋白由717个氨基酸组成,相对分子量为80.9kDa,等电点为6.57,编码蛋白与Cry1Ia1(CAA44633)亲缘关系最高达99.03%的序列同源性,该蛋白被Btδ-内毒素国际命名委员会正式命名为Cry1Ia32(登录号为JX944039)。cry1Ia32基因通过表达载体pET-21b在大肠杆菌中高效表达分子量为81kDa的蛋白,诱导表达的Cry1Ia32蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾的2龄幼虫具有较高杀虫活性,LC50值分别为0.025mg/mL和0.011mg/mL,为抗虫转基因植物研究提供了新的基因。     

双价抗虫基因共转化烟草叶绿体的研究

 分别构建苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因 [BtCryIA(C) ]和水稻巯基蛋白酶基因 (Oryzacystatin ,OC)叶绿体转化载体 ,其中Bt基因叶绿体转化载体以烟草叶绿体基因trnH psbA trnK为同源片段 ,以水稻 (OryzasativaL .)叶绿体 psbA基因启动子和终止子为调控基因 ;OC基因叶绿体表达载体以烟草叶绿体基因片段 psbA ORF5 12为同源片段 ,以烟草叶绿体 16S启动子和终止子为调控基因 ;两载体均以壮观霉素抗性基因 (aadA)为筛选基因。利用基因枪方法 ,共转化烟草叶片 ,获得壮观霉素抗性植株。经Southern、Western检测、表达蛋白活性测定证明 ,双价抗虫基因己整合到烟草叶绿体中并得到表达。转基因植株抗棉铃虫试验表明 ,转基因植株具有显著杀虫活性     

piggyBac转座子介导的牛A-FABP表达载体的构建与鉴定

【目的】构建以piggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin(NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性。【方法】通过PCR方法合成PB转座子骨架序列、NEO-EGFP、α-actin启动子以及A-FABP基因序列,并将各个序列连接构建成转基因载体pPB-AFABP;用脂质体法将供体质粒pPB-AFABP和辅助质粒pCAG-PBase组成的PB二元系统及质粒pPB-AFABP分别转染牛成纤维细胞,通过G418筛选得到转基因细胞。【结果】经过酶切和测序鉴定,载体pPB-AFABP构建正确;PB二元系统的阳性克隆数明显多于转座子载体pPB-AFABP的克隆数;PCR鉴定结果表明,牛成纤维细胞中存在目的基因A-FABP。【结论】成功构建了转基因表达载体pPB-AFABP,且证实PB转座子在牛成纤维细胞中具有较高的转座活性。     

普通烟草IRL基因反义植物表达载体的构建

异黄酮还原酶相似蛋白(IRL)是与异黄酮还原酶具有高度序列同源一致性而功能不同的一类蛋白.通过PCR扩增普通烟草(Nicotiama tabacum)品种龙里红花烟IRL基因的一段特异保守片段NtIRLA,并将其亚克隆到中间载体pCAMBIA2301G中,构建了IRL反义植物表达载体pCAMBIA2301G-IRLA.通过PCR鉴定、酶切鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株,为进一步利用转基因手段明确IRL基因在烟草次生代谢中的功能奠定了基础.     

CMV—Pf—CP基因表达载体的构建及转化西番莲（Passiflora edulis）的研究

以黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV)西番莲分离物的外壳蛋白基因（CMV－Pf-CP)为目的基因，插入pBI121质粒35S启动子后，构建了植物表达载体pBIC；以子叶和胚轴为外植体，初步建立了西番莲转基因体系，采用土壤根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导法进行西番莲转化研究，获得了抗卡那霉的转基因再生植株。通过对所获得的再生植株进行PCR扩增检测，结果表明CMV－Pf-CP基因已导入西番莲植株中。     

双价抗虫转基因水稻的育成及初步鉴定

【目的】构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,为选育广谱、高抗转基因抗虫水稻提供技术参考。【方法】构建半夏凝集素基因(pta)和苏云金杆芽孢菌基因(Bt)两个抗虫基因的双价表达载体p CAMBIA1301-Bt-pta,利用大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404转化水稻恢复系辐恢838,同时对转化植株进行GUS染色及PCR鉴定。【结果】以构建的双价植物表达载体p CAMBIA1301-Bt-pta为模板,PCR扩增到pta基因的部分片段,大小为807 bp,且该载体经HindⅢ酶切后,能得到15854 bp的中间载体p CAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段。对转化植株进行GUS染色,得到3株转基因阳性植株,经PCR鉴定结果显示外源基因已成功导入水稻。【结论】通过构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,成功获得的转基因植株可用于水稻抗虫转基因恢复系及组合的研究,以提高其抗病虫害能力。     

rbcS启动子的克隆及活性鉴定

利用PCR技术从豌豆(Pisum satium Linn)基因组DNA中分离了rbcS基因启动子及叶绿体定位信号编码序列。序列分析表明,扩增片段(1256bp)与已报道序列的相应区域同源性达98.41 %。将其与绿色荧光蛋白基因(GFP)串连在一起,构建了植物表达载体,通过基因枪介导法转化烟草叶片及洋葱表皮细胞。结果表明这一表达系统增强了绿色荧光蛋白基因的瞬时表达,从而为外源基因在转基因植物中的高效表达提供了新的工具,可以实现目的基因的组织特异性和光诱导性表达。     

木薯一个假定的NBS类抗病基因的获得及其功能分析

根据已克隆植物NBS类抗病基因的保守结构域设计一对简并引物．以抗细菌性枯萎病木薯种质E1340基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得大小约0．5kb的产物。该产物克隆、测序后比对木薯基因组数据库,分别获取其上下游各1．7kb和2．0kb的序列,进行基因预测。预测结果表明,扩增到的序列位于一个预测基因内,该基因命名为SNBl。序列分析表明,该基因编码986aa,具有NBS类抗病基因的结构特征,是一个假定的抗病基因,可能在木薯抗细菌性枯萎病过程中发挥重要作用。     

一个木薯候选STK类抗病基因的分离及其生物信息学分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(STK)结构域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列设计了1对简并引物,以细菌性萎蔫病抗/感木薯种质E1340和GR911基因组DNA为模板,通过PCR扩增,均获得大小约0.5 kb的扩增片段。两个片段纯化、克隆、测序后获得完全一致的505 nt序列,比对发现,木薯种质AM560带有和该序列高度同源的核苷酸片段。对包括同源片段上下游各约2.0 kb的大片段序列进行基因预测,获得1个有4个外显子、ORF全长1866 nt的预测基因,命名SSK1。序列分析表明,该基因编码621 aa,有细胞壁受体激酶结合、偶联位点和8个跨膜结构域,具有典型的STK类抗病基因的保守结构,是一个候选的抗病基因,可能在木薯抗病反应中发挥重要作用。     

枯草芽孢杆菌224 yplQ基因敲除及其对溶血性的影响

为了确定枯草芽孢杆菌224(Bacillus subtilis 224,BS224)的溶血基因或引起溶血的主效基因,以枯草芽孢杆菌224基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增yplQ基因上游约1.0 kb和yplQ基因下游0.5 kb两段DNA序列,并以携带新霉素抗性基因的重组质粒pMD18-T-neo为骨架,构建基于yplQ基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yplQ,线性化后电转化至枯草芽孢杆菌224,通过新霉素抗性平板得到36个neor抗性转化子,基因组PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定yplQ18为yplQ基因缺失菌株,将其接种到5%的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测,仍能引起溶血。结果表明,单独敲除枯草芽孢杆菌224染色体上yplQ基因对菌株的溶血性无影响或影响不大。     

番茄匍柄霉SlCmr1基因克隆及其敲除载体的构建

【目的】克隆番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）SlCmr1基因,并构建SlCmr1基因敲除载体,为研究该基因功能打下基础。【方法】根据NCBI数据库提供的番茄匍柄霉基因组信息设计引物,PCR扩增得到SlCmr1基因的DNA全长和CDS序列,并对SlCmr1基因编码的蛋白进行生物信息学分析。利用SlCmr1基因上、下游1100 bp左右的序列设计引物,分别PCR扩增SlCmr1基因的上、下游片段,通过酶切连接的方法将SlCmr1基因的上、下游序列分别插入载体pCX62,构建SlCmr1基因敲除载体。【结果】SlCmr1基因的DNA全长为3275 bp,CDS长度为3018 bp,有3个内含子,编码蛋白序列全长1005 aa,分子式为C₄₈₈₂H₇₆₄₂N₁₄₀₄O₁₄₉₉S₆₁,分子量为111.94 kD,理论等电点为（pI）6.64,半衰期30 h,不稳定指数58.72,亲/疏水性平均值为-0.424,预测亚细胞定位于细胞核,存在2个相邻的ZnF_C2H2结构域和1个GAL4结构域,推测SlCMR1为不含跨膜区域的非分泌、不稳定可溶性蛋白。分别将SlCmr1基因上、下游序列插入pCX62载体,成功构建了基因敲除载体pCX62-SlCmr1。【结论】SlCmr1可能是真菌调控色素合成的关键基因,在真菌的次级代谢产物合成中发挥重要作用。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和移动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat protein,CP)和移动蛋白(Movement protein,MP)基因序列合成了CP和MP基因的上下游引物,通过PCR扩增获得目的片段,经过Sal I和Pst I双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序,构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP,用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白,为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子和克隆寄主因子,以及其种类和功能打下坚实的基础.     

Loxp序列位置对基因表达的影响

【目的】先选用绿色荧光蛋白基因(egfp)作为试验基因构建loxp位点位于egfp基因上游或下游不同位置的表达结构,对loxp位点的位置对基因表达的影响进行初步分析。然后以植酸酶(phytase)基因为另一个试验基因对通过egfp基因得出的结果进行进一步验证。研究结果为开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接共表达的转基因动物制作中,打靶位点的选择提供可靠依据。【方法】先选择增强绿色荧光蛋白基因(egfp)为试验基因,红色荧光蛋白基因(dsred2)为内参基因。以p EGFP-N2、p GEM-5zf-loxp质粒为基础,构建了ploxp-EGFP(loxp序列位于egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区)、p EGFP-loxp(loxp序列位于egfp基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区)、ploxp-EGFP-loxp(egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列)。以p EGFP-N2质粒为对照质粒,以p Ds Red2-N1为内参质粒,与所构建的egfp基因各表达质粒共转染PK15细胞,转染24h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,进而应用SPSS19.0软件对各转染荧光表达情况进行分析,确定loxp序列的位置对基因表达的影响。为了对以egfp基因为试验基因所得到的结果进行进一步验证,本试验选择植酸酶(phytase基因)基因为试验基因,egfp基因为转染内参基因萤火虫荧光素酶基因(luciferase基因)为表达内参基因。以p IREs NEo、p GEM-5zf-loxp和p T-phytase、p GL4.13[luc2/SV40]质粒为基础。构建了p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase(loxp序列位于phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区)、p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp(phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列)、p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp(loxp序列位于phytase基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区)和p-SV40-luciferase-CMV-phytase(phytase基因开放阅读框的上下游均无loxp序列)等试验质粒,以egfp基因(p EGFP-N2)为转染内参基因与所构建的各种phytase基因表达结构共转染PK15细胞,同时设置一个转p EGFP-N2+p Ds Red2-N1的空白对照。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白基因表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,应用SPSS19.0软件对各转染绿色荧光表达情况进行分析。同时应用钼蓝法测定各转染的植酸酶活性。应用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各转染萤火虫荧光素酶活性。用SPSS19.0软件对各转染的植酸酶和萤火虫荧光素酶表达水平(活性)进行统计分析。【结果】试验中以dsred2为内参基因,对转染后每个转染的不同区域红色荧光强度平均值(代表各转染红色荧光蛋白的表达水平)进行统计分析表明egfp基因各结构每个转染的间红色荧光蛋白表达水平差异不显著,表明不同转染间排除了转染操作、质粒纯度、细胞活性等的差异对分析结果的影响,转染前质粒的电泳结果表明,各质粒间不同构象的质粒比例基本一致,这也基本排除了转染用质粒质量的差异对转染效果的影响,对各转染不同区域绿色荧光强度的平均值(代表各转染的egfp基因表达水平)进行的统计分析表明,同一结构不同转染间egfp基因表达水平差异不显著,不同结构的转染间存在差异,其中ploxp-EGFP和ploxp-EGFP-loxp结构转染中绿色荧光蛋白的表达水平显著低于p EGFP-loxp和p EGFP-N2,而p EGFP-loxp和p EGFP-N2转染间egfp基因间的表达差异不显著。这一结果初步说明loxp序列在外源基因开放阅读框下游时对基因表达水平没有影响,在外源基因开放阅读框上游时对基因表达呈负影响,为了进一步验证上述结果的可靠性,本研究以植酸酶基因作为另一试验基因,以萤火虫荧光素酶基因为表达内参基因,以egfp基因为转染内参基因再次进行了验证,验证试验得到了相似的结果。【结论】开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接,实现外源基因和内源基因共表达的转基因动物制作研究中,以Cre/loxp系统作为报告基因删除工具时,则内源基因的下游为最佳的打靶位点。     

过敏反应促进蛋白基因hrap转马铃薯的研究

利用根癌农杆菌介导法,将由甜椒中分离出的一种过敏反应促进蛋白hrap基因导入马铃薯品种"Russet Burbank"和"大西洋"中。转化再生植株经过含卡那霉素培养基的生根筛选、PCR检测、Southern杂交鉴定表明目的基因已导入马铃薯品种中,RT-PCR检测结果表明目的基因已整合到马铃薯DNA中并表达。通过对转基因植株进行活体接种抗病性检测,获得了抗晚疫病和抗青枯病的植株。     

尾穗苋凝集素（ACA）基因植物表达载体的构建

尾穗苋凝集素（Amaranthus caudatusagglutin in,ACA）是一种存在于尾穗苋种子中的贮藏蛋白,属苋菜凝集素家族,对同翅目害虫如蚜虫、褐飞虱、叶蝉等有明显的致死作用。植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS带有35S启动子及终止序列、卡那霉素（Kan）抗性基因NPTⅡ。载体pGEMT-ACA含有ACA基因,通过PCR扩增出ACA基因。把植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS和扩增后的ACA基因用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后经连接酶连接,得到植物表达载体pCAMB IA2300-ACA。将该载体分别导入农杆菌GV3101和LBA4404进行保存。     

花粉管介导的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白转基因棉花的筛选

利用新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因进行遗传转化是培育新疆棉花抗寒品种的新途径。研究采用RT-PCR结合RACE技术从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲(Microdera puntipennis dzungarica)中克隆获得抗冻蛋白(Antifreeze protein)基因MpAFP149。将MpAFP149克隆至pBI121上,获得重组质粒后采用电转化法将重组质粒转入农杆菌EHA105内,PCR筛选鉴定重组子,并测序确定抗冻蛋白植物表达载体构建正确。将pBI121-MpAFP通过田间的花粉管导入技术转化棉花,收取转化的棉花种子,经检测证明在转化10 000朵花中,卡那霉素抗性筛选出13株,PCR检测有2株阳性植株。实验结果为进一步开展抗冻蛋白基因转化棉花的研究奠定了基础。