生姜液预防日本血吸虫尾蚴感染的实验研究

目的：探讨生姜液预防日本血吸虫尾蚴感染的效果以及对皮肤的毒副作用。方法：A组（n=24）小鼠皮肤涂抹生姜液后直接用日本血吸虫尾蚴感染,B组（n=24）小鼠皮肤涂抹生姜液用泥浆水洗擦后感染日本血吸虫尾蚴,观察防护作用。另以生姜液涂于小鼠腹部,观察对皮肤的毒副作用。结果：A组小鼠日本血吸虫尾蚴的感染率为18．18％,减虫率达95．99％;B组小鼠感染率为80．95％,减虫率为4．55％。小鼠皮肤未见异常反应。结论：生姜液涂肤未洗擦时有防御日本血吸虫感染的作用,且对皮肤无明显毒副作用。     

日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白基因的克隆及原核表达

为了得到重组的日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白,研究设计了1对引物,以日本血吸虫mRNA为模板,用RT-PCR方法克隆了576 bp的22.6 ku膜相关蛋白基因片段,测序结果表明,该片段与已公布的Sj22.6基因序列(U75510)同源性达到99%。将该基因片段插入原核表达载体pGEX-KG构建了原核表达质粒pGEX-Sj22.6,在大肠杆菌BL21 codn plus中表达获得了约48 ku的融合蛋白,经Western-blot检测,该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

日本血吸虫SjELAV-like 1的克隆、表达及功能分析

【目的】克隆和表达日本血吸虫胚胎致死异常视觉基因1（SjELAV-like 1）,分析其在日本血吸虫体内的表达情况及定位,探究该基因对日本血吸虫形态和生殖发育的影响。【方法】利用RACE技术扩增5′/3′末端,获得SjELAV-like 1基因序列提交至NCBI,Gene Bank登录号：MG515727,构建该序列的重组表达质粒 pET28-SjELAV-like 1,并在大肠杆菌BL21中利用IPTG诱导表达,收集不同诱导时间的菌体,SDS-PAGE法进行蛋白电泳。利用His镍柱亲和层析法纯化大量表达所得重组蛋白,用纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用于Western blotting 分析虫体内该天然蛋白的免疫原性,以及间接免疫荧光检测该蛋白在虫体内的分布情况。小鼠腹部贴片法感染日本血虫尾蚴,收集虫体不同发育阶段混合和合抱分开的雌、雄虫体,以单钉螺逸出的尾蚴感染小鼠获得25 d单性雌、雄虫体,通过实时定量 PCR分析该基因的表达情况。通过尾静脉注射小干扰RNA（siRNA）于感染小鼠体内,使该基因表达沉默,筛选最佳干扰效果的siRNA,用于长期RNA干扰（RNAi）试验,分析其对日本血吸虫雌虫产卵及卵胚孵化的影响。利用扫描电镜和透射电镜观察RNAi对虫体体被结构及雌、雄虫生殖器官的影响。【结果】获得的1 797 bp的SjELAV-like 1基因序列含有poly A尾,其中编码序列为1 533 bp,编码510个氨基酸。重组质粒pET28-SjELAV-like 1在诱导4 h时表达量最高,主要以包涵体的形式存在,利用纯化蛋白获得了优质多抗,获得的重组蛋白具有良好的免疫原性,经分析发现SjELAV-like 1蛋白主要分布在虫体体被。RT-qPCR 发现SjELAV-like 1在不同时期雌、雄虫体内均有表达,在雄虫体内表达稳定,但在雌虫体内随着发育成熟其表达水平呈下降趋势;在不同感染状态的雌、雄虫体内,与正常发育雌虫相比,该基因在发育阻遏雌虫体内高表达,而在雄虫体内无明显差异。RNAi试验中,与NC组相比,长期干扰组小鼠肝减卵率、雌虫对肝卵贡献减少率和卵胚减孵化率分别为58.27%（P＜0.05）、40.59%（P＜0.01）和74.58%（P＜0.01）;电镜观察发现,干扰组虫体体被结构改变,雄虫体表粘附的泡状物消失,立体的褶脊结构塌陷,整齐排列的条索状皮脊变的疏松,网状结构消失,雌虫体壁表面组织间隙增宽,分布于其上的体棘减少、变钝,雄虫精母细胞数目减少,其内的染色质减少,细胞肿大,细胞间质增宽,雌虫卵黄细胞中卵黄球减少,其中包含的卵黄滴也减少,内质网肿大,皮质颗粒排列散乱。【结论】成功克隆和表达了在日本血吸虫发育阻遏雌虫中高表达的部分SjELAV-like 1基因序列,且发现该基因主要在虫体体被表达。该基因沉默使肝脏荷卵数、雌虫对肝卵贡献率和卵胚孵化率均显著降低,并改变虫体体被结构,抑制生殖腺的正常发育,提示该基因对日本血吸虫的生殖发育有重要的作用。     

应用荧光定量PCR对日本血吸虫miRNAs表达量的研究

近来通过Solexa高通量测序鉴定出了大量日本血吸虫的miRNAs序列,为确定这些miRNAs在日本血吸虫不同生活史阶段的表达量,采用SYBR染料法和Race试剂盒相结合的荧光定量方法对虫卵、尾蚴、14 d童虫、雄虫、雌虫阶段的miRNAs表达量进行了检测分析,发现虫体不同阶段miRNAs表达差异巨大,其中虫卵阶段表达量最低,而虫体其他阶段有着各自的表达特点,同时也用Northern对荧光定量结果进行了进一步的验证。结果表明,这些miRNAs可能在日本血吸虫不同发育阶段的基因转录调控中起着重要作用。     

日本血吸虫合成表位肽疫苗对小鼠的保护性免疫

为观察日本血吸虫合成表位多肽疫苗诱导的保护性免疫,将用日本血吸虫抗原免疫血清筛选噬菌体随机12肽库得到的、具有较好免疫保护性的4个模拟抗原表位短肽进行人工合成,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测它们的抗原性.将合成多肽分别与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)连接后免疫昆明小鼠,第3次免疫后收集血清,检测其针对各个多肽和可溶性成虫抗原(AWA)的IgG抗体滴度,以及补体介导的小鼠体外杀日本血吸虫童虫作用.结果显示,4个合成多肽均能被相应的抗体识别,具有良好的抗原性;能诱导产生特异性IgG抗体.这些抗体在补体参与下能在体外有效毒杀血吸虫童虫.与正常小鼠血清比较,4个合成多肽免疫血清的杀童虫率分别为31.7%,41.3%,21.1%和17.3%,均具有显著性;与KLH免疫血清相比时,杀童虫率分别为23.7%,34.4%,11.8%(P=0.077,无显著性)和7.5%(P=0.102,无显著性).这些结果表明,这4个合成表位多肽具有良好的抗原性和免疫原性,与KLH连接后能诱导明显的抗体反应和显著的细胞毒作用.     

日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶原核表达载体的构建及序列分析

为构建带有组氨酸标签(his-tag)的日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(sjGST)表达载体。以载有sjGST基因的载体PGEX-KG为模板,PCR扩增sjGST基因,并在进行酶切和基因测序后将其克隆到pET28a载体上。运用生物学软件与具有代表性的血吸虫GST基因进行比对并对可能的表达产物进行分析。结果表明,PCR产物与3种sjGST基因有99%的同源性。重组载体构建成功。     

SCHISTOSOME OVA: RAPID SEPARATION FROM MOUSE TISSUE BY DIGESTION WITH PINGUINAIN

High yields of ova of Schistosoma mansoni were obtained from the livers and intestines of infected mice by digestion of the homogenized tissue with the proteolytic enzyme pinguinain.     

Identification of paramyosin as schistosome antigen recognized by intradermally vaccinated mice

Mice immunized intradermally with extracts of Schistosoma mansoni in combination with the adjuvant BCG are significantly protected against subsequent infection with living larval forms of the parasite. Remarkably, these vaccinated animals produce antibodies predominantly against a single parasite protein of molecular weight 97 kilodaltons (Sm-97). A complementary DNA that encodes about half of the Sm-97 molecule has now been cloned and sequenced. Analysis of the deduced amino acid sequence reveals a protein containing periodic repeats of hydrophobic amino acids characteristic of an alpha-helical coiled-coil structure. The deduced amino acid composition of the cloned gene and several properties of the native protein are similar to that of paramyosin, an alpha-helical protein that forms the core for myosin filaments in invertebrate muscle. Paramyosin was isolated from Schistosoma mansoni adult worms and antibodies to Sm-97 were shown to react with this molecule as well as with a known paramyosin from molluscan muscle.     

日本血吸虫新基因SjPP的筛选、克隆及对小鼠的免疫效果

【目的】筛选克隆东方田鼠血清识别的日本血吸虫靶抗原基因，并研究其免疫保护效果。【方法】利用东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA表达文库获得阳性克隆，以5′ RACE技术扩增获基因全长序列，构建含目的基因的核酸疫苗并研究在小鼠中的免疫保护效果。【结果】（1）获得4个日本血吸虫新的EST序列，即mfs-1（GenBank登录号BE974942）、mfs-3（GenBank登录号BE974944）、mfs-4（GenBank登录号BE974945）和mfs-5（GenBank登录号BE974946）。（2）mfs-5进行全长序列克隆，获得的日本血吸虫新基因SjPP(GenBank登录号AY902477)长1311 bp, 编码302个氨基酸，理论分子量为34.7 kD，等电点为5.51；其氨基酸序列具有丝/苏氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine specific protein phosphatase，简称PP）的保守序列LRGNHE，并且含有该酶特异性抑制剂冈田酸的作用位点SAPNYC，与人的PP6、鼠PP6、果蝇PPⅤ等蛋白的氨基酸序列具有高度同源性，分别达72%、70%和70%。（3）成功构建核酸疫苗pCMV-Script／SjPP，免疫BALB/c小鼠诱导产生肝组织减卵率为23.91%，粪便减卵率为31.91%。【结论】（1）获得日本血吸虫新的抗原基因SjPP。（2）含SjPP基因的核酸疫苗在小鼠中诱导了部分免疫保护效果。     

New approach to immunization against Schistosoma japonicum

Previous inoculation of rhesus monkeys with cercariae of the nonhuman strain of Schistosoma japonicum proved to give a rather strong protection against a subsequent challenge with its human strain.     

应用间接血凝试验检测血吸虫抗体

本试验以日本血吸虫水溶性虫卵抗原致敏醛化红血球,建成了检测日本血吸虫抗体的间接血凝试验。应用该法观察血吸虫抗体的消长规律,结果表明:抗体最早于人工感染血吸虫尾蚴后25天出现;吡喹酮治疗后5个月转阴。     

日本血吸虫内源性siRNAs的研究

为鉴定日本血吸虫体内是否存在内源性siRNA,采用生物信息学方法对成虫和14d童虫Solexa测序后得到的序列进行了分析,发现成虫和童虫中确实存在内源性siRNAs,而且所占比例和m iRNAs相当,说明内源性siRNAs可能对日本血吸虫基因转录起着重要调控作用。     

牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的研制及初步评价

为了建立一种检测牛日本血吸虫病的快速诊断技术,试验以乳胶微球标记的兔抗牛IgG抗体作为免疫探针,以血吸虫可溶性抗原为检测线,羊抗兔IgG为质控线,研制了牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。对该试纸条进行了效价、敏感性、特异性、非特异性、保存期、批内批间可重复性及符合率等各项试验,结果表明试纸条的效价为1∶2;对于实验感染日本血吸虫28 d和 35～56 d的病牛血清,试纸条的敏感性分别为20%（2/10—检出阳性份数/检测数）和100%（30/30）;用于检测健康牛血清的特异性为100%（20/20—检出阴性份数/检测数）,检测东毕吸虫、肝片吸虫、锥虫病牛血清,未见交叉反应现象;对于粪孵确诊为血吸虫病阴、阳性的牛血清,试纸条与粪孵法的阴阳性符合率均为100%;与IHA阴阳性符合率也均为100%;试纸条批内批间可重复性好,2～8℃保存的试纸条有效期达15个月。用试纸条检测实验感染血吸虫牛治疗前后体内不同时期血清抗体的水平,发现牛感染血吸虫后第5周的血清均可检测出血吸虫抗体,在治疗后第16～24周血吸虫抗体消失。     

Schistosoma mansoni: development of challenge infections in mice exposed to irradiated cercariae

The principal effect of x-irradiated Schistosoma mansoni cercariae may be to slow the migration and development of the worms of a challenge infection. This would account for the smaller number of worms found in the portal system in the early weeks and the delayed accumulation of recoverable worms and eggs.     

Transfer factor: delayed hypersensitivity to Schistosoma mansoni and tuberculin in Macaca mulatta

Delayed hypersensitivity in Macaca mulatta infected with either Schistosoma mansoni or mycobacteria was demonstrated by biopsies of skin test sites. Both dialyzable and nondialyzable leukocyte extracts from infected donors transferred delayed hypersensitivity to recipient monkeys. In two recipients, skin test conversion was associated with in vitro transformation of the recipients' lymphocytes.     

初生仔猪腹腔消化器官的静脉属枝观察

用乳胶加颜料血管注射的方法,对32例初生仔猪的腹腔消化器官的静脉属枝进行观察。在32例样本中,有1例(3.13%)肠系膜前静脉出现变异,即该静脉由两枝汇合而成。第一枝只收集近侧的多条空肠静脉和胰十二指肠后静脉。第二枝则汇集其余的静脉枝。结肠中静脉的汇入部位有两种情况:(1)有20例(64.52%)汇入肠系膜前静脉;(2)有11例(35.48%)汇入肠系膜后静脉。胃网膜左静脉,有2例(9.09%)不汇入胃脾静脉,而是向右延续为胃网膜右静脉。     

含日本血吸虫可溶性抗原及重组GST的免疫刺激复合物对小鼠的免疫试验

免疫刺激复合物(ISCOM)是 Morein 创立的一种疫苗免疫载体,其中的主要佐剂成分是 Quil A(皂素的一种成分).本研究首先用日本血吸虫中国大陆株成虫可溶性租抗原(SWA)作为免疫抗原,按改进方法结合皂素制备 ISCOM,对其在小鼠体内诱导的免疫保护力和 SWA 在 FCA/FIA、蜂胶二种佐剂条件下的免疫保护力进行了比较研究,然后对不同剂量 SWA-ISCOM 的免疫效果进行考察;最后对重组日本血吸虫中国大陆株28kD GST(rSj28GST)-ISCOM 在小鼠体内所诱导的免疫保护力进行观察.结果表明 IS-COM 在进一步应用于各种基因工程苗方面有研究价值。     

土耳其斯坦裂体吸虫23kDa蛋白基因的序列分析及抗原表位预测

为研究土耳其斯坦裂体吸虫23 kDa蛋白的生物学特性,以土耳其斯坦裂体吸虫cDNA为模版,利用PCR对23 kDa基因进行扩增,并将其克隆到T-easy载体后进行序列测定。利用生物信息学对其结构、抗原指数进行分析,并对其抗原表位进行预测。序列分析结果表明,该虫体的23 kDa基因长度为657 bp,A+T含量为57.38%,与曼氏血吸虫、埃及血吸虫和日本血吸虫的23 kDa基因的相似性分别为85.24%、83.71%和81.89%。蛋白二级结构分析表明,23 kDa蛋白经过4次跨膜,主要由6个α-螺旋、3个β-折叠、7个β转角和若干个无规则卷曲构成。抗原表位预测结果表明,该蛋白有3个B细胞抗原表位。综合分析土耳其斯坦裂体吸虫23 kDa蛋白是一种较好的抗原分子,是土耳其斯坦裂体吸虫疫苗的重要候选分子。     

Hycanthone resistance: development in Schistosoma mansoni

Following the administration of relatively high doses of the antischistosomal drug hycanthone to mice and hamsters infected with Schistosoma mansoni, a number of the worms survived. After a period of 6 to 12 months these parasites resumed production of viable eggs that gave rise to schistosomes that proved resistant to hycanthone and to two other related antischistosomal compounds. This drug resistance has remained stable for three subsequent generations of worms.     

泰山螭霖鱼肠道的解剖学研究

对泰山螭霖鱼(Varicorhinus macrolepi)肠道的解剖学结构进行了研究,结果表明:泰山螭霖鱼无胃,食管之后是肠道,起始端膨大呈球状,且肠道在体腔内呈“S”型走向,肠长比(肠长与体长之比)为3.04。其肠长比(Y)与体长(X)的回归方程为Y=-0.6624+0.253x(R=0.6339)。肠道由前肠、中肠和后肠组成,肠管直径由前肠到后肠逐渐变小。