一个水稻抗逆候选基因OsHMGB3的鉴定与评价

OsHMGB3是一个位于水稻抗旱QTL区段内的抗旱相关候选基因,预测编码一个具有HMGB-UBF-HMG-box结构域的蛋白。Real-time PCR分析表明:OsHMGB3基因在多个组织器官中表达,且能够受到PEG、NaCl、低温、高温等逆境及ABA的诱导表达。对超表达OsHMGB3的转基因水稻进行了苗期甘露醇胁迫处理,转基因植株的鲜重和株高均极显著优于野生型植株,超表达OsHMGB3可提高水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力。该基因对逆境的响应及转基因植株对渗透胁迫的抗性均暗示该基因与水稻抗逆性有密切的关系。     

不同水稻品种OsVDAC8的表达模式比较与亚细胞定位分析

[目的]研究OsVDAC8的理化性质和表达模式,为探究OsVDAC8的功能提供基础。[方法]用生物信息学分析OsVDAC8的结构特征及表达谱,然后通过定量PCR对3个不同水稻品种日本晴(NIP)、粤泰A(YTA)、粤泰B(YTB)不同发育时期的不同组织中OsVDAC8的表达模式进行分析,并通过BiFC对亚细胞定位进行验证。[结果]OsVDAC8编码区全长1 014 bp,编码337 aa,生物信息学分析结果显示,OsVDAC8是具有1个结构域的稳定的定位于线粒体的亲水蛋白,通过11次跨膜形成特异的桶状结构。在ATG上游含有13个与水稻生长发育及胁迫应答相关的顺式作用元件。RiceXPro和MSU Rice Genome Annotation Project水稻基因表达数据库分析结果表明,NIP中OsVDAC8在生殖生长期的茎和花序出现前后幼穗中表达水平最高,在胚乳和根中的表达量较低。对NIP、YTA、YTB 3个水稻品种中OsVDAC8的表达谱分析结果显示,OsVDAC8在3个水稻品种四叶期的叶鞘表达水平都非常高,在花粉内容物充实期都很低,但幼穗发育的不同时期3个品种中表达水平差异很大...     

水稻低温应答基因OsLCL3的分离与功能鉴定

为探明水稻响应低温的分子机制,改良水稻对低温的抗性,从水稻低温诱导表达谱中挑选了1个受低温诱导的基因OsLCL3,通过实时定量PCR和启动子驱动GUS报告基因转化水稻的方法验证其功能。对OsLCL3进行同源蛋白搜索,发现它属于DUF761超家族,并对这个超家族中的部分蛋白序列进行了系统树分析;通过水稻原生质体瞬时表达系统,初步确定OsLCL3蛋白定位于细胞核和细胞质中。在水稻中超量表达OsLCL3基因,并对转基因植株进行低温胁迫处理,发现超量表达OsLCL3的植株在低温胁迫下的电导率显著低于野生型对照植株,胁迫后超量表达植株的存活率显著高于野生型对照植株。结果表明,OsLCL3可能在水稻对低温的应答中起着重要作用。     

水通道蛋白基因OsPIP2;6的功能分析

【目的】分析水稻过表达OsPIP2;6在逆境胁迫条件下的表型差异,探讨水通道蛋白基因在水稻逆境应答中的作用。【方法】构建水稻水通道蛋白OsPIP2;6的过表达载体,通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中,经遗传转化,阳性鉴定,得到转基因植株。通过逆境胁迫下转基因植株的表型分析来探讨OsPIP2;6的功能。【结果】Real-time PCR结果显示,OsPIP2;6受GA、ABA调控。转基因植株的OsPIP2;6表达量显著提高。正常条件下,转基因植株与野生型植株生长发育情况并无显著差异。在逆境胁迫条件下,转基因植株的耐受能力均显著强于野生型植株。【结论】过表达水稻水通道蛋白基因OsPIP2;6的转基因植株表型显示,OsPIP2;6在水稻的抗旱、抗水淹和抗盐中发挥作用。     

水稻PFP基因的克隆及其遗传转化

采用RT–PCR方法,成功克隆到1个与水稻苗期耐热相关的基因PFP,构建了该基因的超表达载体,通过基因枪法转化水稻品种中花17,获得9个转基因阳性植株,与对照相比,T1代转基因植株的苗期耐热性明显增强。33个代表性地方水稻品种的耐热表型与PFP基因型的相关性分析结果表明,PFP基因的基因型与品种的耐热表型存在显著的相关性。本研究中还分析了该基因在盐、4℃低温、PEG和ABA胁迫处理下的基因表达情况。     

OsmiR530正调控水稻的耐旱和耐盐性

以粳稻品种日本晴(CK)和农杆菌介导转化的OsmiR530–OE转基因水稻为材料进行耐旱和耐盐性相关功能的鉴定。结果表明：OsmiR530有2种成熟的序列形式OsmiR530–5p和OsmiR530–3p,其表达量在OsmiR530–OE转基因植株均有明显增加;靶基因表达量预测分析发现,OsmiR530–5p的靶基因OsTAP46、OsC3HC4、OsPWI和OsE1等在OsmiR530–OE转基因植株中的表达都有一定程度的下调;在干旱、盐胁迫条件下,OsmiR530能提高种子的发芽率、根长和苗高以及萌芽期幼苗对干旱胁迫和盐胁迫的耐受性;检测干旱处理植株的SOD、POD和CAT活性,发现OsmiR530–OE转基因水稻的SOD、POD和CAT活性增长显著;对成熟期水稻植株的农艺性状进行统计分析,发现过表达OsmiR530水稻植株的剑叶的叶表面积、千粒质量以及结实率显著降低。推测OsmiR530可以调控水稻对盐胁迫、干旱胁迫的耐受性。     

水稻自噬相关基因OsATG7的功能

通过对OsATG7突变体、OsATG7超表达及干涉转基因植株表型的观察,对OsATG7突变体进行暗胁迫处理并观察自噬体产生情况,检测OsATG7、SGR基因的表达量以及叶绿素含量变化,阐述水稻细胞自噬基因缺失对水稻生长发育的影响。结果显示:OsATG7基因与水稻育性相关,OsATG7基因的缺失导致水稻高度不育;OsATG7基因可以抵抗黑暗对水稻的非生物胁迫作用,随着暗胁迫时间的增加,水稻OsATG7基因表达量显著上升,该基因的缺失导致水稻衰老相关基因SGR表达量急剧上升,叶绿素流失加速,使植株表现出提早衰老的现象。     

水稻OsWRKY78转录因子响应盐胁迫的表达与功能研究

以OsWRKY78基因及其相应的RNAi转基因水稻为研究对象,分析OsWRKY78转录因子响应盐胁迫的表达和功能,研究WRKY转录因子参与水稻耐盐的机制。结果表明:水稻OsWRKY78基因启动子中存在30多个与非生物胁迫相关的顺式调控元件。基因表达和GUS组织化学染色分析表明OsWRKY78的表达受盐诱导。抑制OsWRKY78基因表达可显著增强水稻在种子萌发和小苗生长阶段的耐盐性,一定程度上是通过调节OsLEA3、OsRAB21等与逆境相关基因的表达来实现的。     

过量表达AtNHXS1新基因显著提高水稻的耐盐性

以转基因和野生型水稻为材料,通过农杆菌介导法将AtNHXS1转到水稻植株中花11号中,分析在盐胁迫下Na+、K+含量的变化,对两者耐盐性进行比较,并对转基因株系进行分子鉴定和转录表达分析。结果表明:PCR初步鉴定得到了20个转基因株系,随机挑选2个PCR阳性株系进行Southern blot鉴定,确定AtNHXS1以单拷贝的形式成功插入到水稻基因组中。耐盐性分析表明,在盐胁迫条件下,转基因水稻植株的生长状况、干质量、鲜质量、Na+含量显著优于或高于野生型水稻植株;此外,300mmol/L NaCl处理下,转基因水稻植株能够正常存活,而野生型水稻5d内几乎全部死亡。将300mmol/L NaCl处理过的植株在无盐胁迫的条件下进行恢复生长试验,转基因植株10d内恢复正常,而野生型则不能。过量表达改组后的AtNHXS1新基因显著提高了水稻的耐盐性。     

番茄SlWRKY23基因的克隆及其抗病性和耐盐性分析

WRKY转录因子是普遍存在于植物界中的一类转录因子,参与了植物在生物和非生物逆境胁迫中的多种应答。前期研究表明,在PstDC3000侵染及盐胁迫下番茄SlWRKY23基因的表达水平提高。为了研究番茄SlWRKY23转录因子对PstDC3000的抗病性及在盐胁迫逆境中的功能,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得转SlWRKY23基因植株,并对3个独立的转基因株系（WRKY23\|1、WRKY23\|5和WRKY23\|7）进行了抗逆性分析。结果表明接种PstDC3000后,转基因植株表现明显的抗病表型,抗病防御相关基因SlPR1和SlPR1a1的表达量显著高于野生型;盐胁迫处理后,转基因植株表现出明显的抗盐表型,逆性相关基因SlRD22和SlDREB2A的表达量显著高于野生型。该结果表明SlWRKY23基因在番茄抗PstDC3000和盐胁迫过程中具有正调控作用,通过上调逆性相关基因的表达量增强抗逆性。     

玉米质膜内在蛋白ZmPIP2;6响应渗透、盐和干旱胁迫的功能鉴定

【目的】质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)广泛存在于植物细胞的膜系统上,在植物体内水分运输和水分平衡的过程中至关重要。对ZmPIP2;6在植物水分胁迫耐性中的功能进行探究,为玉米培育抗旱耐盐新品种提供优秀基因资源。【方法】分析并比对ZmPIP2;6与其他物种中报道参与水分胁迫的PIPs的氨基酸序列,构建ZmPIP2;6-GFP载体并通过PEG介导转化玉米原生质体,对ZmPIP2;6进行亚细胞定位。采集玉米的不同组织样品,包括根、茎、叶、未成熟雄穗、未成熟雌穗、胚和胚乳;对玉米进行PEG或NaCl处理,在处理的不同时间点采集玉米的根和叶样品。提取总RNA并通过qRT-PCR调查ZmPIP2;6在玉米不同组织以及在水分胁迫下的表达模式。构建ZmPIP2;6超表达载体,发展并鉴定ZmPIP2;6超表达拟南芥材料,观察转基因植株对渗透、盐及干旱胁迫的耐性生理表型,并测量其根长、叶片水分散失率等性状。检测在干旱或盐胁迫条件下,拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达。【结果】氨基酸序列分析比对结果显示ZmPIP2;6具有PIP蛋白的典型结构与并且其他物种的PIP蛋白具有很高的同源性。转化玉米原生质体试验结果显示ZmPIP2;6蛋白定位在细胞质膜。qRT-PCR结果显示ZmPIP2;6在玉米未成熟雄穗中表达量最高,并且在玉米受到渗透和盐胁迫后根和叶中的ZmPIP2;6表达受到显著诱导。在MS固体培养基上进行渗透胁迫处理和盐胁迫处理以及进一步的土培试验中进行干旱胁迫处理,ZmPIP2;6超表达拟南芥植株相对野生型都显示出更强的胁迫耐性。在干旱或盐胁迫条件下,拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达受到不同程度的影响。【结论】玉米内在质膜蛋白基因ZmPIP2;6在渗透或盐胁迫下表达上调,在拟南芥中超表达ZmPIP2;6会增强植株对渗透、盐和干旱胁迫的耐性,并且在盐或干旱胁迫条件下会影响拟南芥中胁迫相关基因的表达。ZmPIP2;6可能参与植物水分胁迫响应过程。     

水稻永绿色基因对细胞壁主要成分含量的影响

研究了水稻永绿色基因(SCR)突变和超表达对水稻细胞壁成分含量的影响.结果表明,SGR基因突变对水稻植株细胞壁主要成分含量没有显著影响;SGR基因超表达对水稻植株细胞壁中纤维素、木质素和果胶的含量没有显著影响,但显著降低了半纤维素的含量.     

水稻根系盐胁迫响应miRNA和tRF的鉴定

【目的】水稻(Oryza sativa L.)是中国最重要的粮食作物,也是盐胁迫敏感作物。研究水稻盐胁迫响应基因表达,发掘水稻耐盐基因对水稻抵御盐胁迫的分子机制及解析其调控网络,为培育耐盐水稻品种奠定基础。【方法】以水稻品种日本晴种子为试验材料,在1/2MS培养基培养条件下对其进行盐处理(150 mmol·L-1 NaCl),对盐处理和非盐处理21 d的根系进行小分子量RNA组学测序。通过生物信息学分析,以log2 Fold Change(log2FC)1或-1为筛选条件,寻找在盐胁迫和非盐胁迫条件下差异表达的miRNA和tRF(tRNA-derived RNA fragments),分析其靶基因,并通过实时荧光定量PCR对测序结果及靶基因进行验证。【结果】以至少一组数据RPM(Reads Per Million reads)500和log2FC1或-1为筛选条件,共得到31个差异表达miRNA,其中8个为盐胁迫诱导miRNA,23个为盐胁迫抑制miRNA,这些差异表达miRNA属于12个miRNA家族,其中8个miRNA家族在拟南芥、玉米和小麦等物种中也被报道为盐胁迫信号响应miRNA,包括盐胁迫抑制的osa-miR397、osa-miR396、osa-miR156、osa-miR167、osa-miR1432和盐胁迫诱导的osa-miR159、osa-miR168、osa-miR164。其余4个miRNA家族osa-miR1882、osa-miR1876、osa-miR1423和osa-miR5077尚未见与盐胁迫相关的报道。通过靶基因预测,得到这31个差异表达miRNA的靶基因共162个。此外,盐处理后,水稻根系产生的34—38nt tRF数量显著多于非盐处理材料,说明tRF的产生并非随机,而是通过某种特定机制响应高盐信号,诱发tRNA特异性加工而产生。以RPM50和log2FC1或-1为筛选条件,检测到盐胁迫诱导的5'端tRF 3个,3'端tRF 3个,这些tRF由6个tRNA加工产生。推测这些差异tRF是潜在的水稻盐胁迫响应tRF。【结论】共检测到12种水稻根系中盐胁迫响应miRNA,其靶基因多为转录因子编码基因,推测其通过对其靶基因转录因子的转录后调控参与了盐胁迫响应的表达调控。其中8个水稻盐胁迫响应miRNA家族是不同物种间保守的通用盐胁迫响应miRNA。另外,从转录组水平挖掘出水稻盐胁迫响应tRF,并鉴定了6个盐胁迫诱导表达的tRF。     

小麦耐盐相关基因TaRSTR的克隆与功能分析

高盐是限制植物生长和发育的重要非生物胁迫因子。以耐盐小麦RH8706-49根部基因表达谱芯片结果为基础,利用电子克隆和RT-PCR方法克隆了一个盐胁迫时上调表达的基因,命名为TaRSTR(登录号:EU263918)。荧光定量PCR分析证实该基因受盐胁迫诱导表达,亚细胞定位结果显示TaRSTR蛋白定位在细胞核里。TaRSTR过表达提高了转基因拟南芥在盐胁迫下的种子萌发率及成年植株的耐受性。TaRSTR基因过表达可显著提高已知耐盐相关基因At FRY1、At P5CS1和AtRD29B的表达量,推测TaRSTR基因通过这些标记基因提高了转基因拟南芥的耐盐性。上述结果表明TaRSTR基因过表达能提高植株的耐盐性,是植物耐盐的正调节子。     

水稻vdac3基因超表达载体的构建和遗传转化

以构建水稻osvdac3基因超表达载体并获得超表达的转基因水稻植株为目标,通过PCR扩增将水稻osvdac3基因的全长片段克隆到植物表达载体,构建CaMV35S∶∶osvdac3∶∶rfp植物超表达载体.并以水稻YTB品种作为其遗传转化的受体,通过农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻遗传转化.结果表明,利用该方法成功构建了水稻osvdac3基因超表达载体,在此基础上获得了多个osvdac3基因超表达的水稻植株,并使用RT-PCR技术分析了阳性植株中osvdac3基因的表达水平.该研究结果为进一步研究水稻osvdac3基因蛋白的功能奠定了基础.     

玉米质膜内在蛋白ZmPIP2;6响应渗透、盐和 干旱胁迫的功能鉴定

【目的】质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）广泛存在于植物细胞的膜系统上,在植物体内水分运输和水分平衡的过程中至关重要。对ZmPIP2;6在植物水分胁迫耐性中的功能进行探究,为玉米培育抗旱耐盐新品种提供优秀基因资源。【方法】分析并比对ZmPIP2;6与其他物种中报道参与水分胁迫的PIPs的氨基酸序列,构建ZmPIP2;6-GFP载体并通过PEG介导转化玉米原生质体,对ZmPIP2;6进行亚细胞定位。采集玉米的不同组织样品,包括根、茎、叶、未成熟雄穗、未成熟雌穗、胚和胚乳;对玉米进行PEG或NaCl处理,在处理的不同时间点采集玉米的根和叶样品。提取总RNA并通过qRT-PCR调查ZmPIP2;6在玉米不同组织以及在水分胁迫下的表达模式。构建ZmPIP2;6超表达载体,发展并鉴定ZmPIP2;6超表达拟南芥材料,观察转基因植株对渗透、盐及干旱胁迫的耐性生理表型,并测量其根长、叶片水分散失率等性状。检测在干旱或盐胁迫条件下,拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达。【结果】氨基酸序列分析比对结果显示ZmPIP2;6具有PIP蛋白的典型结构与并且其他物种的PIP蛋白具有很高的同源性。转化玉米原生质体试验结果显示ZmPIP2;6蛋白定位在细胞质膜。qRT-PCR结果显示ZmPIP2;6在玉米未成熟雄穗中表达量最高,并且在玉米受到渗透和盐胁迫后根和叶中的ZmPIP2;6表达受到显著诱导。在MS固体培养基上进行渗透胁迫处理和盐胁迫处理以及进一步的土培试验中进行干旱胁迫处理,ZmPIP2;6超表达拟南芥植株相对野生型都显示出更强的胁迫耐性。在干旱或盐胁迫条件下,拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达受到不同程度的影响。【结论】玉米内在质膜蛋白基因ZmPIP2;6在渗透或盐胁迫下表达上调,在拟南芥中超表达ZmPIP2;6会增强植株对渗透、盐和干旱胁迫的耐性,并且在盐或干旱胁迫条件下会影响拟南芥中胁迫相关基因的表达。ZmPIP2;6可能参与植物水分胁迫响应过程。     

水稻根系盐胁迫响应miRNA和tRF的鉴定

【目的】水稻（Oryza sativa L.）是中国最重要的粮食作物,也是盐胁迫敏感作物。研究水稻盐胁迫响应基因表达,发掘水稻耐盐基因对水稻抵御盐胁迫的分子机制及解析其调控网络,为培育耐盐水稻品种奠定基础。【方法】以水稻品种日本晴种子为试验材料,在1/2MS培养基培养条件下对其进行盐处理（150 mmol·L^-1 NaCl）,对盐处理和非盐处理21 d的根系进行小分子量RNA组学测序。通过生物信息学分析,以log₂ Fold Change（log₂FC）>1或＜-1为筛选条件,寻找在盐胁迫和非盐胁迫条件下差异表达的miRNA和tRF（tRNA-derived RNA fragments）,分析其靶基因,并通过实时荧光定量PCR对测序结果及靶基因进行验证。【结果】以至少一组数据RPM（Reads Per Million reads）>500和log₂FC>1或＜-1为筛选条件,共得到31个差异表达miRNA,其中8个为盐胁迫诱导miRNA,23个为盐胁迫抑制miRNA,这些差异表达miRNA属于12个miRNA家族,其中8个miRNA家族在拟南芥、玉米和小麦等物种中也被报道为盐胁迫信号响应miRNA,包括盐胁迫抑制的osa-miR397、osa-miR396、osa-miR156、osa-miR167、osa-miR1432和盐胁迫诱导的osa-miR159、osa-miR168、osa-miR164。其余4个miRNA家族osa-miR1882、osa-miR1876、osa-miR1423和osa-miR5077尚未见与盐胁迫相关的报道。通过靶基因预测,得到这31个差异表达miRNA的靶基因共162个。此外,盐处理后,水稻根系产生的34—38nt tRF数量显著多于非盐处理材料,说明tRF的产生并非随机,而是通过某种特定机制响应高盐信号,诱发tRNA特异性加工而产生。以RPM>50和log₂FC>1或＜-1为筛选条件,检测到盐胁迫诱导的5'端tRF 3个,3'端tRF 3个,这些tRF由6个tRNA加工产生。推测这些差异tRF是潜在的水稻盐胁迫响应tRF。【结论】共检测到12种水稻根系中盐胁迫响应miRNA,其靶基因多为转录因子编码基因,推测其通过对其靶基因转录因子的转录后调控参与了盐胁迫响应的表达调控。其中8个水稻盐胁迫响应miRNA家族是不同物种间保守的通用盐胁迫响应miRNA。另外,从转录组水平挖掘出水稻盐胁迫响应tRF,并鉴定了6个盐胁迫诱导表达的tRF。     

盐及ABA对水稻MYB转录因子基因表达的影响

转录因子在植物生长发育和响应外界环境胁迫过程中起重要作用。MYB类转录因子是植物中数量较多、功能多样化的一类转录因子。以耐盐聚合系177,以及该聚合系的轮回亲本IR64为材料,在苗期进行盐和盐+ABA处理,采用荧光定量PCR方法,比较分析了43个MYB家族基因在盐胁迫和盐+ABA处理下的表达谱。结果表明,在盐胁迫条件下,IR64和177中分别有42%和58%的MYB基因在叶片组织中下调表达,而外施ABA后,61%（IR64）和68%（177）的下调基因表达量显著增强。该结果说明盐处理条件下通过外施ABA能够引起MYB基因的表达变化,进而影响水稻的耐盐性。同时鉴定了12个在IR64和177间显著差异表达的MYB基因,该类基因的表达模式可能同两个品种具有不同的耐盐性紧密相关。该结果为进一步分析水稻MYB基因在响应盐胁迫过程中的作用机制以及ABA在增强水稻耐盐性方面提供了理论参考。     

一个水稻MYB基因的功能初步分析

从水稻中分离获得的一个新的、功能未知的MYB基因,序列分析发现是一个典型的R2R3-MYB转录因子,与拟南芥中的MYB106高度同源,因此命名为OsMYB106。亚细胞定位检测结果表明,OsMYB106蛋白定位于细胞核中。Real Time PCR结果显示OsMYB106在水稻幼穗时期表达最高,并且受干旱、盐处理和冷胁迫的显著诱导上升表达。OsMYB106RNAi抑制植株表现出矮化以及花粉败育。基因表达分析显示花粉发育相关基因OsMS2和CYP704B2在抑制植株中表达显著降低,揭示OsMYB106可能是通过调控OsMS2和CYP704B2介导花粉细胞壁的发育进而影响花粉的育性。     

水稻转录因子Os1137的克隆及其耐盐性分析

通过PCR方法从水稻cDNA中克隆得到转录因子Os1137的编码基因,构建由ubi启动子驱动的该基因的植物表达载体p3300-Os1137,并用农杆菌介导法将其导入烟草,研究不同盐浓度下转基因烟草的生理指标,分析其抗盐性。结果表明,将该基因导入烟草植株中能够显著抑制NaCl胁迫下植物体内MDA含量的增加,并能够提高植物体内的脯氨酸含量。该基因能够提高转基因烟草植株的抗盐性。